MTA1基因對宮頸癌細胞HeLa侵襲轉移的影響

[摘要] 目的 探索MTA1基因與宮頸癌細胞HeLa侵襲遷移能力的關系。 方法 以脂質體LipofectamineTM2000介導的方法將含有MTA1全長基因的質粒pEGFP-C1/MTA1轉染HeLa細胞，應用Western blotting檢測轉染效果，細胞黏附實驗檢測細胞黏附能力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化，Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力的變化。結果 MTA1質粒轉染的宮頸癌HeLa細胞中，MTA1蛋白的表達、黏附能力、遷移及侵襲能力均明顯高于轉染空載體組及未轉染組（P＜0.05）。結論 MTA1基因與宮頸癌細胞的侵襲遷移能力有關，MTA1基因可能成為宮頸癌治療的一個新的靶點。

[關鍵詞] 轉移相關基因1；宮頸癌；腫瘤轉移

[中圖分類號] R737.33[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2011）20-15-03

The Influence of MTA1 Gene in Invasion and Metastasis of Cervical Cancer

ZHU YimingYANG Zhengyan

Department of Gynecology Oncology，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，China

[Abstract] Objective To study the relativity between MTA1 and invasion and migration of cervical cancer cells. Methods The plasmid pEGFP-C1/MTA1 inserted by the full length cDNA encoding human MTA1 gene was transiently transfected into HeLa cells by LipofectamineTM2000. The expression of MTA1 protein was investigated by Western blotting. Cell adhesion ability change was detected by cellular adhesive experiment. Migration rate was measured by wound healing assay. Furthermore，the abilities of cell invasion and metastasis were investigated using Transwell chambers. Results The cell adhesion，invasion and migration ability was increased after MTA1 over-expression mediated by pEGFP-C1/MTA1 transfection in HeLa cells（P＜0.05）. Conclusion Over-expression of MTA1 gene significantly increased the cell invasion，migration，and adhesion ability. MTA1 could serve as a potential therapeutic target in cervical cancer.

[Key words] Metastasis-associated 1；Cervical cancer；Tumor migration

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，其發病率及病死率呈逐年上升的趨勢[1]。侵襲、轉移是影響宮頸癌病死率及預后的主要因素[2-4]。研究表明，MTA1在許多腫瘤中都表達上調。MTA1基因屬于組蛋白去乙酰基酶（HDAC）家族的一個成分，能夠通過改變組蛋白的乙酰化狀態進行調控基因的表達，使得一些癌細胞向著更具有侵襲性的表型轉化。然而，MTA1在宮頸癌中的研究卻極少，因此我們選取了宮頸癌細胞HeLa檢測其MTA1的表達情況，并且觀察MTA1對其轉移、侵襲的影響。

1材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞系HeLa購自美國典型物種保存中心（ATCC），置于含10%的胎牛血清、100U/mL鏈霉素及100U/mL青霉素的DMEM培養基（購自Gibco公司），在37℃、5%CO2培養箱中培養，24h更新新鮮培養基。0.25%胰蛋白酶消化，收集并傳代。選取對數生殖期細胞用于實驗。羊抗人MTA1多克隆抗體（1︰200），鼠抗人β-actin單克隆抗體（1︰1000）及二抗IgG（1︰1000）購自Santa Cruz公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，Transwell孔板購自美國Corning公司。PCR純化試劑盒購自美國Qiagen公司，基質膠購自B.D.公司，PCR引物序列由廣州銳博生物公司合成。pEGFP-C1由山東大學分子生物實驗室惠贈。

1.2實驗方法

1.2.1正義全長MTA1真核表達載體的構建并轉染宮頸癌細胞系HeLa根據MTA1基因序列，設計其全長表達引物并進行PCR。提取人宮頸癌細胞系HeLa細胞中的總RNA逆轉錄成cDNA。PCR擴增條件：94℃變性1min，56℃退火40s，72℃延伸30s，40個循環后，72℃延伸10min。產物瓊脂糖凝膠電泳，PCR純化試劑盒純化，與雙酶切后的pEGFP-C1載體黏端連接，轉化，測序，獲得正義表達載體pEGFP-C1/MTA1。MTA1全長表達引物序列如下：上游引物5’-AGCGTCACCCTGCTCAACGAGACCG-3’；下游引物5’-GGTTGGCCTCTGATGCAGACCACTC-3’。pEGFP-C1/MTA1送廣州銳博生物公司測序，鑒定為正確序列。按照LipofectamineTM2000說明書操作，將pEGFP-C1/MTA1及pEGFP-C1質粒瞬時轉染HeLa細胞，PBS作為空白對照。培養48h后，將細胞分為pEGFP-C1/MTA1組、pEGFP-C1組及對照組進行實驗。

1.2.2Western blotting檢測Snail蛋白的表達取蛋白質樣品上樣，以12%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離樣品，轉膜，封閉液室溫封閉后加入一抗羊抗人MTA1多克隆抗體（1︰200）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（1︰1000），然后4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記二抗IgG（1︰1000），37℃孵育1h，加入ECL，暗室曝光、顯影、定影。

1.2.3細胞黏附能力實驗轉染48h后，于預鋪Matrigel（100μg/mL）的96孔板每孔中加入1×105細胞，設3個平行孔，分別在孵育20、40、60min后用PBS洗滌以除去未黏附的細胞。MTT法檢測570nm處的吸光度（A）值。黏附細胞比例（%）=黏附于Matrigel上細胞的A值/總細胞A值×100%。

1.2.4細胞劃痕實驗轉染48h后，將生長狀態良好的細胞接種于6孔培養板中，待細胞長到完全融合時，用200μL黃色槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕進行劃痕，PBS沖洗2次后繼續培養，分別與8h、16h后在倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕愈合情況并照相，以細胞劃痕愈合百分比表示細胞的運動能力（0h的細胞劃痕愈合為0%）。

1.2.5Transwell小室體外侵襲實驗將Transwell小室置于24孔板內，每個孔下室內加入10%小牛血清的DMEM培養液500μL，上室加入200μL細胞懸液，每組設5個復孔，常規培養12h。取出Transwell小室，95%乙醇固定，棉拭子擦去小室內面的基質膠，4%多聚甲醛固定，HE染色，顯微鏡下觀察并照相。

1.3統計學處理

實驗數據均經SPSS13.0統計軟件處理，結果以（χ±s）表示，兩組之間均數的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1轉染pEGFP-C1/MTA1后MTA1蛋白表達的改變

轉染后，pEGFP-C1/MTA1組MTA1蛋白的表達明顯高于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。各組的相對表達量見表1。

2.2細胞黏附能力檢測

細胞黏附能力實驗結果顯示細胞種植30min后黏附率pEGFP-C1/MTA1組明顯高于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）。各組細胞種植30min后黏附率見表1。

2.3單層細胞劃痕實驗檢測腫瘤細胞的遷移能力

單層細胞受傷的24h內只能靠細胞的移動來愈合，所以單層細胞劃痕實驗可以反映細胞的遷移能力。單層細胞劃痕實驗顯示，pEGFP-C1/MTA1組細胞的遷移速度明顯快于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）（圖2）。各組細胞的劃痕愈合百分比見表1。

2.4細胞侵襲能力的比較

Matrigel膠能在聚碳酸酯微孔濾膜表面形成類似基底膜的結果，所以細胞穿過Matrigel的情況可以反映出腫瘤細胞的侵襲能力。Transwell侵襲小室實驗結果顯示，pEGFP-C1/MTA1組穿膜細胞數明顯多于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3）。各組的穿膜細胞數見表1。

注：MTA1蛋白的表達：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.087，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.081，P＜0.05；細胞黏附率：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=1.067，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較 t=1.054，P＜0.05；細胞劃痕愈合百分比：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.101，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.091，P＜0.05；穿膜細胞數：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=1.661，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較 t=1.597，P＜0.05

3討論

MTA1基因是Toh等運用差異cDNA文庫掃描技術從高轉移大鼠乳腺腺癌細胞系中發現的，隨后用同源的方法發現了人的MTA1基因。除睪丸外的正常組織中，如心臟、肝臟、腦、肺臟、腎臟中MTA1都呈低水平表達，說明MTA1基因參與了正常細胞的增殖過程。近年來研究發現，MTA1在多種惡性腫瘤組織中過表達，并且過表達的癌組織具有明顯的高侵襲率和淋巴結轉移率，容易發生血行轉移[5，6]。符麗華等[7]運用RT-PCR檢測了53例新鮮宮頸癌組織標本，發現宮頸癌組織MTA1 mRNA表達量明顯增高，并且與宮頸癌的臨床分期及轉移有關。但是目前在分子水平有關MTA1與宮頸癌細胞轉移浸潤的研究鮮有報道。

本實驗選取了宮頸癌HeLa細胞為研究對象，對其轉入全長正義MTA1質粒進行干預，結果發現pEGFP-C1/MTA1組MTA1蛋白的表達較pEGFP-C1組和對照組明顯增強，并且pEGFP-C1/MTA1組較pEGFP-C1組和對照組細胞黏附率高、劃痕愈合能力強、穿膜細胞數多，說明pEGFP-C1/MTA1組在異質間黏附能力、侵襲轉移能力方面均明顯增強，這與MTA1在其他惡性腫瘤中的研究結果一致。目前MTA1增強腫瘤細胞侵襲轉移能力的具體機制尚不明確，但是明確的是MTA1蛋白能夠與組蛋白去乙酰化酶結合，去除組蛋白的乙酰基從而重塑染色質的結構，因此MTA1能夠直接或者間接地作用于某些抑制腫瘤浸潤轉移的基因，下調其轉錄從而促進腫瘤的浸潤轉移。

本研究中我們證實了MTA1與宮頸癌HeLa細胞的侵襲轉移能力的關系，為宮頸癌分子轉移機制提出了理論依據，并且為宮頸癌的靶向治療提供了新的參考靶點。

[參考文獻]

[1] 顧曉梅，張玉泉. 宮頸癌的流行病學高危因素研究進展[J]. 中國婦幼保健，2007，22（35）：5073-5075.

[2] Long HJ 3rd. Management of metastatic cervical cancer：review of the literature[J]. J Clin Oncol，2007，25（20）：2966-2974.

[3] Dara E，Rouzier R，Ballester M，et al. Sentinel lymph node biopsy in gynaecological cancers：the importance of micrometastases in cervical cancer[J]. Surg Oncol，2008，17（3）：227-235.

[4] Kisseljov F，Sakharova O，Kondratjeva T. Cellular and molecular biological aspects of cervical intraepithelial neoplasia[J]. Int Rev Cell Mol Biol，2008，271：35-95.

[5] Dannenmann C，Shabani N，Friese K，et al. The metastasis-associated gene MTA1 is upregulated in advanced ovarian cancer，represses ER beta，and enhances expression of oncogenic cytokine GRO[J]. Cancer Biol Ther，2008，7（9）：1460-1467.

[6] Balasenthil S，Broaddus RR，Kumar R. Expression of metastasis-associated protein 1（MTA1）in benign endometrium and endometrial adenocarcinomas[J]. Hum Pathol，2006，37（6）：656-661.

[7] 符麗華，熊小英. MTA1基因在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 中國婦幼健康研究，2006，17（5）：349-351.

（收稿日期：2011-05-09）

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