大鼠腎缺血再灌注對Smad7表達的影響

[摘要]目的探討大鼠腎缺血再灌注后不同時間點Smad7的表達，尋找臨床預測急性腎功能衰竭的新指標及治療的新手段。方法建立大鼠腎缺血再灌注模型，當再灌注達相應時間點時，采用全自動生化分析儀、免疫組化、HE染色分別測定或觀察血肌酐、尿素氮、腎組織Smad7表達、腎組織病理改變。結果①腎功能改變：與假手術組比較，0h、4h、12h、24h時模型組BUN及Cr均高于假手術組（P＜0.01）。②腎臟組織學改變：模型組的腎組織損傷較假手術組明顯加重。③腎組織Smad7的表達：模型組與同一時間點假手術組比較，在0h時腎臟Smad7陽性表達兩組表達無差異（P＞0.05）；在4h、12h、24h模型組腎臟Smad7陽性表達較假手術組均減少（P均＜0.01）。 結論 隨著腎功能逐漸惡化的同時Smad7表達不斷減少。

[關鍵詞] Smad7表達；腎缺血再灌注損傷；血肌酐；血尿素氮

[中圖分類號] R692.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）20-06-03

Influence of Smad7 Expression in Renal Ischemia-Reperfusion Injury of Rats

XU JunnanWANGRongrongWANG Zhiyi WANG ZhengGONG YuqiangSUN LaifangCHEN Daqing

Department of Emergency Medicine，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou University，Wenzhou 325027，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate Smad7’s expression in different time in renal ischemia-reperfusion injury（IRI）and search new clinical index and method to forecast acute renal failure. Methods Establishing the model of renal ischemia-reperfusion， When reperfused to the corresponding time point， blood samples were obtained for measurement of serum levels of creatinine（Cr） and blood urea nitrogen（BUN）.Renal tissue was used for histological examination and immuohistochemical analysis of Smad7. Results①Renal function change： Compared with the control group at the time point of 4h，12h，24h after reperfusion， the serum levels of BUN and Cr in the subgroup of the model group were significantly higher（P＜0.01）；②Renal cellular damages in the model group showed more severe than those in the control group； ③Expression of Smad7 in kidney of 0h reperfusion were not different statistically in two groups （P＞0.05）. Expression of Smad7 in kidney of the model group were lower significantly in 4h，12h，24h reperfusion than the control group（P＜0.01）. ConclusionWith the gradual deterioration of renal function，the expression of Smad7 is decreased.

[Keywords] Smad7 expression；Ischemia-reperfusion injury； Creatinine； Blood urea nitrogen

腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指腎臟缺血組織在重新獲得血供后，組織細胞損傷未見減輕反而加重的一種病理現象。TGF-β/Smads蛋白通路是腎臟非常重要的一條信號轉導途徑，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信號通路中最重要的內源性抑制因子，是Smads蛋白家族中的重要一員。前人對此通路作了大量的研究，作為引起急性腎衰腎前性因素的缺血再灌注在此方面研究較少，為了弄清楚腎缺血再灌注時Smad7表達是增加[1]還是減少，因此設計本實驗并進行如下報道。

1材料與方法

1.1實驗材料

健康雄性SD大鼠80只，月齡6個月，體重220～250g，一級動物，由溫州醫學院實驗動物中心提供。Smad7抗體、SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德生物試劑公司提供。DAB顯色液由北京中杉金橋試劑公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及方法 雄性SD大鼠80只，隨機分為假手術組（A組）和腎缺血再灌注損傷模型組（B組），每組40只，組內按再灌注時間不同又分為再灌注0h、4h、12h、24h 4個小組，每組10只，分別在再灌注到0h、4h、12h、24h時取材。B組建立腎缺血再灌注模型；A組僅作麻醉、開腹，不阻斷血流；再灌注達相應時間點時，從各小組大鼠腹主動脈取血2mL備測血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），然后迅速切除左腎，腎組織用10%甲醛固定，制備石蠟切片，作HE染色觀察病理變化以及作免疫組化分析腎組織Smad7表達情況。采用全自動生化分析儀、免疫組化、HE染色分別測定或觀察血肌酐、尿素氮、腎組織Smad7表達、腎組織病理改變。

1.2.2腎缺血再灌注動物模型制作及標本采集所有實驗動物均術前12h禁食，自由進水。實驗大鼠應用10%的水合氯醛按300mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，碘酒酒精消毒手術切口部位，在劍突到恥骨聯合之間沿腹白線作一長約6cm的縱切口開腹，找到雙側腎臟，小心分離右側腎蒂、左側腎蒂，用無損傷動脈夾夾閉左右側腎蒂，阻斷出入腎臟血流（在此過程中注意保持實驗大鼠體溫及減少腹腔的不顯性失水），見腎顏色由紅潤變為暗紅，表明腎血流阻斷，45min后重新恢復腎臟血液灌注。當松開動脈夾后腎臟在2～5min內顏色由暗紅轉為鮮紅表明缺血再灌注損傷模型建立成功，腎血管無血栓形成，關腹。若超過5min腎臟顏色仍然未轉為鮮紅色則認為腎臟有血栓形成，排除實驗組。假手術組游離出雙側腎蒂而不進行夾閉，45min后關腹。實驗大鼠麻醉清醒后轉入代謝籠內自由進水及進食，再灌注達相應時間點時，從各小組大鼠腹主動脈取血2mL備測血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），然后迅速切除左腎，置于冰鹽水中，洗凈表面血液，腎組織用 10%甲醛固定，制備石蠟切片。

1.3指標檢測

1.3.1腎功能檢測 所取血液標本1500r/min離心30min，用微量加樣器吸取上清，置于EP管中，4℃保存于冰箱中。肌酐、尿素氮檢測由溫州醫學院附屬第二醫院檢驗科協助完成。

1.3.2HE染色制備腎組織石蠟切片，經HE染色后，光鏡下觀察腎組織病理改變。

1.3.3免疫組織化學分析石蠟切片經免疫組化處理后，采用Image Plus Pro6.0軟件分析免疫組化結果：視野里棕黃色顆粒視為陽性著色，根據著色深淺程度分級：無著色（陰性），淺黃色（弱陽性），棕黃色（陽性），深棕黃色（強陽性）。

1.4統計學方法

采用SPSS12.0 for Windows軟件包對實驗數據進行統計學處理，數據以均數±標準差（χ±s）表示，采取方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1腎功能變化

與同一時間點假手術組比較，模型組各小組血漿BUN均顯著升高（P＜0.01），見表1。同組內不同時間點間BUN的比較：在模型組中各時間點之間比較方差分析有統計學意義（F=49.77，P＜0.01）。其中隨再灌注時間的延長，任一時間點均較前時間點BUN明顯升高，差異有統計學意義（P均＜0.01）。假手術內各小組無明顯差異（F=0.031，P＞0.05）。與同一時間點假手術組比較，模型組各組血漿Cr均高于假手術組（P＜0.01）。見表2。同組內不同時間點間血Cr的比較：模型組中各時間點之間比較方差分析具有統計學意義（F=96.748，P＜0.01）。其中隨再灌注時間的延長，任一時間點均較前時間點Cr明顯升高，差異有統計學意義（P均＜0.01）。假手術內各小組無明顯差異（F=0.018，P＞0.05）。

2.2腎組織形態的改變

假手術組腎小球、腎小管結構完整（封三圖1）。腎IR模型組腎臟病理變化明顯，多數腎小管上皮細胞腫脹，出現水樣變性，部分凝固性壞死、脫落，刷狀緣消失，腎小管腔內可見管型，腎間質血管高度擴張充血，可見灶性出血區和灶性炎細胞浸潤，但腎小球病變不明顯（封三圖2~6）。

2.3各組腎組織中Smad7表達情況

在0h時腎臟Smad7陽性表達兩組表達無差異（P＞0.05）。見表3。模型組腎臟Smad7陽性表達較假手術組在4h、12h、24h均減少（P均＜0.01）。模型組中各時間點之間比較方差分析具有統計學意義（F=126.150，P＜0.01），其中再灌注0h組Smad7表達的平均光密度較其他各組明顯多，差異有統計學意義（P＜0.01）。24h組較4h、12h的平均光密度較大（P＜0.01），4h和12h組平均光密度無統計學差異（P＞0.05）。見封三圖7~10。

3討論

近年來，國內外許多學者研究發現，在各種原因引起的腎功能衰竭中，TGF-β不僅可以抑制小管細胞的增殖并誘導其凋亡，還可誘導小管細胞轉分化為肌成纖維細胞（MyoF）[2，3]。與配體結合后，TGF-β家族受體激活了一個由Smad蛋白家族介導的獨特的信號轉導通路，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信號通路中最重要的內源性抑制因子[4]。有學者在研究中發現TGF-β誘導小管細胞生長停滯、凋亡以及小管間質纖維化與其細胞內Smad7負調控作用的不足有關[5]。先前研究表明Smad7的負調控作用存在缺點，Itoh等[6]觀察到缺乏配體時，Smad7主要位于細胞核內，有配體存在時，Smad7需完成核到胞質轉移過程才能與受體結合，該負調控機制存在反應緩慢，而且也存在蛋白合成不足的問題，因此，有學者采用基因轉移技術將外源性的Smad7基因轉染到培養的腎小管細胞中，Smad7基因轉移后可明顯拮抗TGF-β1誘導的G1停滯，提高G2、S的細胞的分布，減低小管細胞的凋亡，可明顯拮抗TGF-β1刺激小管細胞分泌FN[7]。

在腎缺血再灌注的研究中發現TGF-β1表達呈增加趨勢[8]，在以往的梗阻性腎病研究中發現TGF-β1表達也逐漸增多，Smad7表達減少[9]。Smad7在TGF-β信號傳導中是自身調節負反饋機制的重要因子[10]，因此Smad7無論在生理還是病理情況下對細胞內環境的穩定均具有重要作用。本實驗研究結果表明在缺血再灌注后模型組肌酐、尿素氮逐漸升高，腎組織形態學變化表明腎組織損傷逐漸加重，Smad7表達逐漸減少，在再灌注24h檢測到Smad7表達較再灌注12h有所升高，但腎組織損傷仍進一步加重，從而進一步說明Smad7對TGF-β/Smads蛋白信號通路負調控機制反應緩慢，在無外界因素促Smad7表達增加情況下，難以拮抗腎缺血再灌注對腎臟的進一步損傷。因此在病理狀態下，尋找上調Smad7因子表達的方法，減輕缺血再灌注對腎臟的急性期及遠期損傷是值得我們繼續研究的嶄新領域。

[參考文獻]

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（收稿日期：2011-03-28）

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