纈沙坦與氟伐他汀降低阿霉素腎病大鼠蛋白尿及腎組織NF-κB表達實驗研究

[摘要] 目的 探討纈沙坦與氟伐他汀對阿霉素（ADR）腎病大鼠蛋白尿及腎組織核因子κB（NF-κB）表達的影響。方法 雄性SD大鼠120只，適應性喂養2周后，隨機抽取18只為正常對照組(A組)；另外102只制作阿霉素腎病模型。84只造模成功大鼠隨機分為4組：B組為模型對照組（等容積生理鹽水， n=21），C組為纈沙坦治療組[纈沙坦3.5mg/（kg·d），n=21]，D組為氟伐他汀治療組[氟伐他汀10mg/（kg·d），n=21]，E組為纈沙坦與氟伐他汀聯合治療組[纈沙坦3.5mg/（kg·d） 加氟伐他汀10mg/（kg·d），n=21]。其后，分別于2、6、10周末，遵循隨機化原則，按n=6分層抽取各組樣本，收集24h尿液、血液及腎組織標本待測。結果 與A組相比，B組、C組、D組和E組24h尿蛋白排泄、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）濃度明顯升高（P＜0.01）；免疫組化染色表明， NF-κB陽性積分明顯升高（P＜0.01）；纈沙坦與氟伐他汀單用及聯用尿蛋白排泄減少，血清TC、TG濃度降低（P＜0.05 或 P＜0.01），腎臟NF-κB表達降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。結論 纈沙坦與氟伐他汀可減輕阿霉素腎病大鼠蛋白尿、降低血清TG、TC濃度，降低腎臟NF-κB表達，聯用時療效更明顯。提示纈沙坦與氟伐他汀至少部分通過降低NF-κB表達而減輕腎臟損害。

[關鍵詞] 阿霉素腎病；纈沙坦；氟伐他汀；核因子κB

[中圖分類號] R587.2[文獻標識碼] A[文章編號]1673-9701（2011）21-06-03

Effect of Valsartan and Fluvastatin on Reducting the Expression of Proteinuria and Nuclear Factor-κB (NF-κB) in Adriamycin-induced Nephrotic Rats

ZHANG DaoyouWU XiaodongCUI MingchunYANG YanlangYANG LicaiZHU Xinjian.

Departnent of Nephrology， Affiliated Yijishan Hospital，Wannan Medical College，Wuhu 241001，China

[Abstract] Objective To investigate the influence effct of valsartan and fluvastatin on reducting the expression of proteinuria and nuclear factor -κB（NF-κB）in adriamycin-induced nephrotic rats. Methods Male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly separated into five groups and given different therapies. Normal control group（group A，n=18）. Nephrotic model was induced by tail introvenously injection of ADR（6.0mg/kg）. Eighty-four ADR-induced nephrotic male SD rats were randomly divided into 4 groups: model control group(group B: normal saline 3mL/d，n=21)， valsartan treatment group(group C， valsartan 3.5mg/（kg·d）， n=21），fluvastatin treatment group(group D， fluvastatin 10mg/（kg·d）， n=21） and combining valsartan with fluvastatin treatment group(group E，valsartan 3.5mg/（kg·d）plus fluvastatin 10mg/（kg·d）， n=21）. After the end of therapies for 2， 6， and 10 weeks， the samples of 24h urine ， serum were collected and assayed (six rats were assigned randomly in every group). The renal specimens were taken for the immunohistochemistry of nuclear transcription factor-κB（NF-κB）. Results Compared with group A， 24h urinary protein excretion， the serum levels of total cholesterol， and triglyceride were increased significantly in B， C， D，and E groups（P＜0.01）. Treatment with either valsartan or fluvastatin or combined valsartan with fluvastatin could reduce 24h urinary protein excretion， decrease the serum levels of total cholesterol， triglyceride （P＜0.05 or P＜0.01）， inhibit the expression of NF-κB in renal tissues. Conclusion valsartan and fluvastatin can decrease proteinuria， decrease serum triglyceride， total cholesterol and the expression of NF-κB in renal tissues in ADR-induced nephrotic rats. Combining valsartan with fluvastatin has superiority effects over monotherapies. These results suggest that Valsartan and fluvastatin may mediated through， at least partly， decreasing the expression of NF-κB in renal tissues and attenuating renal damage.

[Key words] Adriamycin-induced nephropathy; Valsartan ; Fluvastatin; Nuclear factor -κB（NF-κB）

腎小球硬化、腎血管硬化和腎間質纖維化是腎功能減退的始動因素，控制或延緩腎纖維化或硬化是治療的關鍵。研究表明，核因子κB（NF-κB）過度活化與腎臟纖維化有關。近年有研究表明，噻唑烷二酮對實驗性糖尿病腎病的腎損傷的保護作用至少部分是通過抑制NF-κB活化、ICAM-1的表達及巨噬細胞浸潤而實現的[1]。為此，我們制備大鼠阿霉素腎病模型，并予以纈沙坦及氟伐他汀干預，探討阿霉素腎病大鼠NF-κB的變化及藥物對蛋白尿及NF-κB表達的影響。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Sprague-Dawlay 雄性大鼠，體重180～220g，平均（200±20）g，浙江省實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2003-0001，在恒溫22℃、相對濕度65％～70％、光照周期12h環境中適應喂養2周后進行試驗。

1.1.2 藥物與試劑 ① 阿霉素注射劑（浙江海正制藥有限公司）；②纈沙坦（北京諾華制藥有限公司）；③氟伐他汀鈉膠囊（北京諾華制藥有限公司）；④NF-κB免疫組化試劑盒(兔抗鼠單抗，P65/Rel-A，SC-8088，北京中杉金橋生物有限公司)；⑤DAB顯色劑（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立腎病綜合征大鼠模型及分組 120只大鼠適應性喂養2周后隨機抽取18只為正常對照組（A組），余102只于尾靜脈注射ADR制備NS模型，尾靜脈一次性注射ADR 6.0mg/kg，2周末收集24h尿，測24h尿蛋白＞100mg確定為造模成功。正常對照組大鼠尾靜脈注射0.5mL生理鹽水。2周后造模成功的84只大鼠再隨機分為NS模型組（B組，n=21）、纈沙坦治療組（C組，n=21）、氟伐他汀治療組（D組，n=21）、纈沙坦與氟伐他汀聯合治療組（E組，n=21），開始干預治療。A組及B組生理鹽水3mL/d；C組以纈沙坦3.5mg/（kg·d）；D組以氟伐他汀10mg/（kg·d）；E組劑量比照單一用藥，均予灌胃。

1.2.2 標本收集 分別在干預治療后第2、6、10周末分階段每次隨機處死6只大鼠，處死前收集24h尿，記錄尿量，3000r/min離心15min，去除沉渣后-20℃冰箱中保存。以3%戊巴比妥鈉0.15mL/kg麻醉，腹主動脈取血，3000r/min離心15min后，取上清液保存在-20℃冰箱中。取左側腎臟去包膜后長軸對切，10%甲醛固定，石蠟包埋，以用于免疫組織化學檢測。

1.2.3 血、尿生化指標測定 血甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）檢測送我院檢驗科生化室，采用全自動生化分析儀檢測（日立 7170）；24h尿蛋白采用雙縮脲法檢測。

1.2.4 NF-κB免疫組織化學染色 嚴格按試劑盒說明書操作。陽性結果判定:以胞核、胞漿內棕褐色顆粒為陽性。用免疫組化分析系統(HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統，同濟醫學院清屏影像公司)分析：每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選擇15個視野的腎小球，用雙盲法分別檢測每個視野內NF-κB的陽性細胞數，主要觀察系膜細胞、上皮細胞、內皮細胞及浸潤的炎性細胞。均值表示每組視野中陽性細胞數。

1.2.5 統計學處理 由SPSS13.0統計分析軟件完成。所有數據采用均數±標準差（χ±s）表示，組間比較方差齊性者采用單因素方差分析，組內比較采用LSD-t、SNK-q檢驗。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.124h尿蛋白定量及生化指標測定

阿霉素注射后2周，B、C、D、E組24h尿蛋白、TG、TC水平較A組明顯升高（P＜0.01）；與B組相比，C、D、E組均降低（P＜0.01）。其中E組較C、D組明顯降低（P＜0.01）。而C組24h尿蛋白較D組數值雖有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

注：與A組相比具有統計學意義（▼P＜0.01） ；與B組相比具有統計學意義（△P＜0.01） ； 與C、D組相比具有統計學意義（★P＜0.01） ；與C組相比無統計學意義（▲P＞ 0.05）

2.2免疫組化腎組織NF-κB表達的變化

A組2、6、10周末NF-κB主要在腎小球及腎小管上皮細胞的胞漿表達，很少在胞核內表達。B組2、6、10周末NF-κB 在細胞核內表達較A組明顯（P＜0.01），隨著時間的延長，表達愈為增強（P＜0.01）；C、D、E組2、6、10周末NF-κB 在細胞核內表達較A組明顯（P＜0.01），但明顯低于B組（P＜0.01）。見表2、圖1。

注：與A組相比具有統計學意義（▼P＜0.01） ；與B組相比具有統計學意義（△P＜0.01） ；與C組、D組相比具有統計學意義（＃P＜0.01） ；與第2周相比具有統計學意義（★P＜0.01）；與C組相比無統計學意義（*P＞0.05）

3#8195;討論

Bertani等給大鼠注射阿霉素，約2周出現蛋白尿，4周達病變高峰，大鼠出現水腫、大量蛋白尿和高脂血癥等腎病綜合征表現，其病理改變主要表現為腎小球上皮細胞組突融合、消失和腎小管上皮細胞與腎小球基底膜的局部分離，蛋白尿可持續數月，約半年可誘發腎小球硬化[2]。目前認為。阿霉素腎病模型是經典的動物模型，類似于局灶性節段性腎小球硬化，其特點是腎小球濾過率（GFR）降低，蛋白尿、腎小球硬化、腎小球濾過膜通透性改變，小管間質纖維化等[3]。本實驗采用尾靜脈一次性注射阿霉素6.0mg/kg，成功制備大鼠阿霉素腎病模型。表現為蛋白尿，脂質代謝異常等。

NF-κB是Rel蛋白家族成員，由于其能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子上含10個寡核苷酸區（GGGACTTTCC）位點特異結合，故命名為NF-κB。靜息狀態下，NF-κB與抑制性蛋白IκB結合以非活性異寡聚體形式滯留在胞漿中，不具轉錄活性。當細胞受到胞外信號多種因素的刺激時，可引起一系列連鎖的酶促反應，最終使NF-κB與IκB解離，NF-κB活化并易位到核內，與其靶基因中啟動子或增強子上的κB序列結合，可以誘導或調節許多因子的轉錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細胞趨化因子=1（MCP-1）、細胞間黏附因子-1（ICAM-1）、轉化生長因子β1（TGF-β1）等，參與炎癥反應、免疫反應、氧化應激和凋亡等一系列病理生理過程的發生和發展[4]。Kumar等研究發現[5]，NF-κB可導致腎組織單核巨噬細胞浸潤，從而大量分泌細胞因子、炎癥介質及產生氧自由基等，促使細胞外基質（ECM）合成增加。本實驗結果亦顯示，與正常組相比，模型組與治療組NF-κB活性明顯升高且隨著病程延長而加重，而在治療組中隨NF-κB的抑制即伴隨著檢測指標的好轉。因此通過阻斷AngⅡ等對NF-κB的激活可能是其腎臟保護作用機制之一。Mezzano等[6]研究發現，用類似于腎病綜合征患者尿中發現的濃集白蛋白培養腎小管內皮細胞，可以引起NF-κB活性增加和炎癥因子的上調。實驗中我們亦觀察到NF-κB表達與尿蛋白水平明顯相關。

腎素-血管緊張素系統（RAS）在腎臟疾病進展中十分重要，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ)主要作用于AT1，影響血液動力學，產生機械損傷[7]；還可通過非血液動力學作用損傷腎臟。在AngⅡ非血液動力學作用中對轉化生長因子-β(TGF-β)、NF-κB 的釋放最為重要。同時TGF-β又可通過Samd信號轉導途徑活化[8]，促進炎癥細胞浸潤和炎癥因子（NF-κB等）釋放，最終促進細胞增殖、ECM聚集、抑制ECM降解，導致腎臟纖維化[9]。而NF-κB的活化反過來又可通過自分泌方式促進AngⅡ生成，形成惡性循環[10]。纈沙坦為非肽類、口服有效的AngⅡ受體拮抗劑，對Ⅰ型受體（AT1）有高度選擇性，可通過血流動力學和非血流動力學作用阻斷對NF-κB的活化，從而達到降低蛋白尿、抗炎、減少ECM聚集，減輕腎纖維化之作用。

脂質紊亂也可加速腎臟疾病的進展，脂質和炎癥協同無疑加重腎毒性。在NS中高脂血癥導致活性氧等氧自由基的大量釋放以及脂質的過氧化，活性氧簇（ROS）途徑可活化系膜細胞中NF-κB[12]，ROS已被認為是NF-κB激活的重要中介分子，其機制可能是通過PKC-NF-κB依賴途徑活化MsC中NF-κB，促使系膜細胞增殖。使用PKC及ROS抑制劑即可有效抑制NF-κB的活化。由此可見，降低NS患者血脂水平，可減少NF-κB的活化，延緩腎病綜合征的進展。UsuiH等[13]在研究中證實他汀類藥物除了降低血脂作用外，還可通過抑制由NF-κB引起的細胞因子等的表達，改善腎血流動力學的異常及抗氧化等非依賴降脂的腎保護作用而延緩腎臟病變的進展。此外，脂蛋白尤以OX-LDL等在腎臟的沉積可促進系膜細胞增殖、細胞因子的釋放及纖維連接蛋白等ECM增多，最終腎小球逐漸趨于硬化[14]。而ARB可以阻斷OX-LDL的生成，并增強細胞抗氧化能力。Bernardo等[15]在NS大鼠中采用奧美沙坦和普伐他汀聯合治療可明顯降低血脂及尿蛋白，升高血白蛋白，抑制免疫細胞浸潤，改善腎功能及減輕腎纖維化。氟伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，可降低膽固醇及甘油三酯濃度。本次實驗結果顯示，氟伐他汀組較模型組腎臟NF-κB的活性明顯降低，從而證實了他汀可抑制NF-κB的活化。而纈沙坦和氟伐他汀聯合治療療效更為明顯，說明多重阻斷阿霉素腎病的腎損傷因素可以更好地保護腎臟。

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（收稿日期：2010-08-18）

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