Bmi-1\\P14及P16蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其意義

[摘要] 目的 探討B(tài)mi-1、P14及P16蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法 選擇60份結(jié)腸癌組織標(biāo)本及60份癌旁正常結(jié)腸組織，采用組化免疫方法染色，觀察Bmi-1、P14及P16蛋白的表達(dá)強(qiáng)度、陽(yáng)性率及其相關(guān)關(guān)系。結(jié)果Bmi-1蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度、陽(yáng)性率高于正常結(jié)腸組織，P14及P16蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)強(qiáng)度及陽(yáng)性率低于正常結(jié)腸癌組織。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織Bmi-1蛋白表達(dá)同P14及P16蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.419，P＜0.05；r=-0.372，P＜0.05），P14同P16蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.537，P＜0.05）。結(jié)論Bmi-1蛋白在結(jié)腸癌組織過(guò)度表達(dá)，其可能對(duì)P14及P16蛋白的負(fù)向調(diào)控在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；Bmi-1蛋白；P14蛋白；P16蛋白

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.3+5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）27-102-02

Expression and Significance of Bmi-1，P14 and P16 Proteinum in Colon Carcinoma Tissue

CAI Ke1NI Shichang2JIANG Sanya1SHI Bailing1

1.Department of Surgery，the Third Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Province Zhongshan Hospital，Hangzhou 310005，China；2.Department of Anus，Rectum and Colon Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance and expression of Bmi-1，P14 and P16 proteinum in colon carcinoma tissue. Methods Sixty tissues of colon carcinoma and sixty tissues of normal colon were selected and stain with immunizing histological chemistry way. Expression intensity and positive ratio of Bmi-1，P14 and P16 proteinum were detected and correlation between Bmi-1，P14 and P16 proteinum were analysized. Results Expression intensity and positive ratio of Bmi-1 were higher in tissues of colon carcinoma than in tissues of normal colon，expression intensity and positive ratio of P14 and P16 proteinum were lower in tissues of colon carcinoma than in tissues of normal colon， correlation test showed that there were negative correlation between Bmi-1 and P14，P16 proteinum （r=-0.419， P＜0.05；r=-0.372， P＜0.05），there was positive correlation between P14 and P16 proteinum（r=0.537， P＜0.05）. Conclusion Bmi-1 proteinum was over expression in tissues of colon carcinoma，that maybe have a effect in genesis and genesis of colon carcinoma by negative-going control to P14 and P16 proteinum.

[Key words] Colon carcinoma；Bmi-1 proteinum；P14 proteinum；P16 proteinum

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，結(jié)腸癌的發(fā)生是多因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果，腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)異常與結(jié)腸癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，尤其與細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白，在對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程中可能引起細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致細(xì)胞永生化發(fā)生癌變，Bmi-1、P14及P16蛋白是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，本文就其在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及其相互關(guān)系進(jìn)行研究，探討其在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇我院2006年6月～2010年6月手術(shù)切除的結(jié)腸癌標(biāo)本及腫瘤癌旁正常結(jié)腸組織各60份，其中結(jié)腸癌標(biāo)本來(lái)源患者年齡37～84歲，平均（64.0±7.2）歲，正常結(jié)腸組織來(lái)源患者年齡35～81歲，平均（63.0±10.4）歲，兩組標(biāo)本來(lái)源中患者年齡及性別無(wú)顯著差異，具有可比性。

1.2試劑及儀器

兔抗人多克隆Bmi-1、P14及P16抗體（南京建成生物工程研究所），SP、DAB超敏顯色試劑盒（武漢博士德生物工程研究所）。冰凍切片機(jī)（上海精密儀表廠），微波抗原修復(fù)儀（常州電子儀器廠），恒溫水浴箱（上海精密儀表廠），400目顯微鏡（北京儀器廠）。

1.3染色方法及觀察方法

結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織標(biāo)本免疫組化染色方法采用三步SP法[1]，病理標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4μm厚度連續(xù)切片，展片機(jī)常規(guī)展片、烘干，微波修復(fù)抗原，抗雜質(zhì)抗原采用非免疫山羊血清隔夜孵育后去除，采用PBS緩沖液沖洗后滴加一抗4℃孵育過(guò)夜，充分反應(yīng)后PBS緩沖液沖洗三次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃條件下恒溫孵育30min，充分反應(yīng)后PBS緩沖液沖洗，然后滴加反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，終止反應(yīng)后自來(lái)水沖洗5min，采用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS緩沖液常規(guī)返藍(lán)，95%酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。

1.4結(jié)果判斷

染色結(jié)果判斷采用計(jì)數(shù)法，采用400目光鏡下選擇5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，依據(jù)細(xì)胞染色情況。染色程度及染色細(xì)胞數(shù)量判定結(jié)果、淺棕色背景下視野內(nèi)細(xì)胞不著色（－，陰性），棕色背景下視野內(nèi)細(xì)胞淡藍(lán)或者褐色染色為陽(yáng)性，5個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞染色計(jì)數(shù)，如果視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)累加占全部細(xì)胞累加數(shù)目小于1/3（++，中等陽(yáng)性），1/3~1/2分為（+++，中等陽(yáng)性），大于1/2（++++）為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0漢語(yǔ)版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Bmi-1、P14及P16蛋白在結(jié)腸癌組織的表達(dá)（表1）

結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織Bmi-1蛋白主要在細(xì)胞核及細(xì)胞漿表達(dá)，P14蛋白主要在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)表達(dá)、P16蛋白主要在細(xì)胞核表達(dá)、陽(yáng)性表達(dá)者呈現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒樣染色，Bmi-1、P14及P16蛋白在結(jié)腸癌組織表達(dá)陽(yáng)性率分別為90.0%、23.3%及28.3%，在正常結(jié)腸組織表達(dá)陽(yáng)性率分別為31.7%、76.7%及70.0%，結(jié)腸癌組織Bmi-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于正常結(jié)腸組織，P14及P16表達(dá)陽(yáng)性率低于正常結(jié)腸組織。

表1Bmi-1、P14及P16蛋白在結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)

[n（%）]

組織nBmi-1 P14 P16

結(jié)腸癌組織 60 54（90.0）14（23.3） 17（28.3）

正常結(jié)腸組織 60 19（31.7）46（76.7） 42（70.0）

χ2 8.26 6.91 5.42

P0.004 0.005 0.008

2.2 結(jié)腸癌組織Bmi-1蛋白與P14和P16蛋白表達(dá)相關(guān)關(guān)系（表2）

在結(jié)腸癌組織中，Bmi-1與P14蛋白同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為12例，約為20.0%，同時(shí)陰性表達(dá)例數(shù)為4例，比例約為6.7%；在結(jié)腸癌組織，Bmi-1與P14蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.419，P=0.002），在結(jié)腸癌組織，Bmi-1與P16蛋白同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)者14例，比例約為23.3%，同時(shí)陰性表達(dá)者3例，比例約為5.0%，在結(jié)腸癌組織，Bmi-1與P14蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.372， P=0.021）。

表2結(jié)腸癌組織 Bmi-1蛋白與P14和P16蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

Bmi-1P14合計(jì)P16合計(jì)

＋－＋－

＋ 12 42 54 144054

－24 63 3 6

合計(jì)144660 17 4360

2.3結(jié)腸癌組織P14與 P16表達(dá)的相關(guān)關(guān)系（表3）

在結(jié)腸癌組織，P14及P16蛋白同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)者為13例，比例約為21.7%，同時(shí)陰性表達(dá)者比例42例，比例約為70.0%，在結(jié)腸癌組織，P14同P16蛋白表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

表3結(jié)腸癌組織P14與 P16表達(dá)的相關(guān)性分析

P14P16合計(jì)

＋－

＋13114

－ 4 4246

合計(jì)174360

3討論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率較高，結(jié)腸癌的發(fā)生過(guò)程是抑癌因子與促癌因子失衡的過(guò)程，大部分與惡性腫瘤相關(guān)的細(xì)胞因子都與細(xì)胞周期密切相關(guān)，或者作用于細(xì)胞分裂周期關(guān)鍵的酶，引起細(xì)胞周期的異常，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖及凋亡機(jī)制的失衡，導(dǎo)致組織細(xì)胞惡變。Bmi-1、P14及P16蛋白均是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，Bmi-1蛋白是Ploycomb組蛋白（Ploycomb-group，PcG）家族成員之一，PcG組蛋白在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮對(duì)控制基因活性的調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體發(fā)生及發(fā)育過(guò)程中，其調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，PcG家族基因過(guò)度表達(dá)或發(fā)生突變時(shí)，都會(huì)引起機(jī)體發(fā)育異常或畸形，甚至誘發(fā)腫瘤的形成。Bmi-1蛋白參與原始干細(xì)胞的分化、細(xì)胞周期調(diào)控以及衰老等生命過(guò)程[2]。在細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程中起著主要作用，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Bmi-1蛋白可上調(diào)hTERT的轉(zhuǎn)錄，使端粒不能夠隨細(xì)胞的分化、增殖逐漸縮短，引起細(xì)胞的增殖活性增高，凋亡機(jī)制減弱，甚至引起細(xì)胞永生化，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用[3]，Bmi-1蛋白的過(guò)度表達(dá)可能是細(xì)胞惡變的始動(dòng)機(jī)制之一。P14及P16蛋白是抑癌基因INK4a/ARF編碼的蛋白質(zhì)，P16蛋白為細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑， P16蛋白主要作用于細(xì)胞G1期向S期的演進(jìn)過(guò)程，能夠通過(guò)對(duì)CyclinD與CDK4/CDK6結(jié)合活性的調(diào)節(jié)，激活CDK4/CDK6，繼而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子合成，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期[4]，在此調(diào)節(jié)鏈中p16INK4a蛋白起著負(fù)反饋的作用，對(duì)細(xì)胞增殖周期起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。一旦p16INK4a基因發(fā)生變異，將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，P16的表達(dá)缺失甚至能夠作為腫瘤的早期事件對(duì)腫瘤的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測(cè)。P14為可變讀框基因（alter-ative reading frame，ARF），由外顯子1β、2和3編碼，由132個(gè)氨基酸組成，分子量為1390Da的蛋白質(zhì)。p14ARF蛋白能穩(wěn)定和提高細(xì)胞p53水平[5]，增強(qiáng)p53在G1/S期和G2/M期的限制點(diǎn)效應(yīng)，最終使細(xì)胞阻滯于G1期和G2期，具有細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控作用。

研究表明[6]，P14蛋白缺失的小鼠能夠形成腫瘤，表明 P14蛋白在腫瘤發(fā)生中可能起一定作用。在結(jié)腸癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)，Bmi-1蛋白在結(jié)腸癌組織過(guò)度表達(dá)，而P14和P16蛋白存在明顯的表達(dá)缺失現(xiàn)象，說(shuō)明Bmi-1、P14及P16蛋白共同參與直腸癌的發(fā)生過(guò)程。對(duì)結(jié)腸癌組織Bmi-1、P14及P16蛋白表達(dá)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織Bmi-1表達(dá)同P14及P16蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明其可能通過(guò)對(duì)P14及P16蛋白表達(dá)的負(fù)性調(diào)控，進(jìn)而使細(xì)胞凋亡機(jī)制失常，引起細(xì)胞的異常增殖。既往的研究也證實(shí)，Bmi-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制細(xì)胞的P16的表達(dá)，延長(zhǎng)細(xì)胞的生存周期[7]。但在正常老化細(xì)胞中，Bmi-1并不下調(diào)P16蛋白表達(dá)，表明可能存在其與細(xì)胞增殖有關(guān)的Bmi-1靶點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡抑制時(shí)靶點(diǎn)激活。研究結(jié)果也顯示，結(jié)腸癌的發(fā)生并非單一細(xì)胞因子或促癌因素引起的，而是多因素共同作用的結(jié)果，Bmi-1、P14及P16均參與結(jié)腸癌的發(fā)病過(guò)程并存在相互的調(diào)控關(guān)系。

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（收稿日期：2011-07-07）