表皮干細胞分化結(jié)膜上皮細胞基因檢測的實驗研究

[摘要] 目的 通過實時RT-PCR方法檢測經(jīng)定向誘導(dǎo)分化的表皮干細胞分子生物學(xué)特性，探討干細胞療法用于眼表重建的可行性。方法 實驗組細胞以結(jié)膜上皮細胞為飼養(yǎng)細胞進行共培養(yǎng)，并設(shè)立空白對照組細胞培養(yǎng)相同時間，分別于第1、3、5、7天取各組細胞提取RNA進行實時RT-PCR定量檢測β2-微球蛋白、角蛋白K13基因的表達水平。結(jié)果 實驗組細胞共同培養(yǎng)3d后出現(xiàn)β2-微球蛋白、角蛋白K13基因的表達，第5、7天的表達量顯著提高（P＜0.01）。結(jié)論 經(jīng)本實驗方法定向誘導(dǎo)分化后表皮干細胞可表達與正常結(jié)膜上皮細胞相類似的分子生物學(xué)特征。

[關(guān)鍵詞] 皮膚干細胞；結(jié)膜上皮細胞；實時RT-PCR

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）27-10-03

Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium

MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2

1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220， China；2.Zhongshan Ophthalmic Center， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510060，China

[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR， and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time， and after 1， 3， 5， 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group， and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.

[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR

表皮干細胞為皮膚組織中的專能干細胞，是一種成年組織干細胞[1]，可增殖分化為表皮中各種細胞成分，保持皮膚正常的表皮結(jié)構(gòu)。表皮干細胞的分化方式有兩種：對稱分裂和不對稱分裂。前者分裂成兩個和母細胞相同的子代干細胞；而后者則分裂成一個子代干細胞和一個與母細胞不同的短暫擴增細胞（TAC）[2]，TAC屬定向祖細胞。近年來干細胞療法已成為治療多種疾病的新途徑，可替代、修復(fù)、加強受損的組織或器官的功能[3]。本研究應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)將表皮干細胞體外定向誘導(dǎo)分化為結(jié)膜上皮細胞，通過對目的細胞生物特性的檢測，探討其在臨床眼表結(jié)膜重建治療中的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1人皮膚材料包皮標本來自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)患者，無泌尿系統(tǒng)疾病感染，患者年齡18～30歲，所取包皮標本均得到患者知情同意。

1.1.2結(jié)膜組織取自尸體眼正常結(jié)膜組織。

1.1.3試劑和儀器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；熒光定量試劑盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司（美國）；TRIZOLreg; Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；RNA提取反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自Promega公司（美國）；RoboCyclerreg;Gradient Temperature Cycler PCR儀（Stratagene公司，美國）；MJ Research OpticonTM4熒光定量PCR儀（美國）。

1.2方法

1.2.1飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)取尸體眼結(jié)膜，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍，于無菌超凈臺剪除結(jié)膜下筋膜組織，將其上皮面向上平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，棄去消化液并用無菌虹膜恢復(fù)器刮取上皮組織，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化約20min，待倒置顯微鏡下見到上皮細胞充分消化為多個單細胞狀態(tài)時加入上皮細胞培養(yǎng)液中止消化，收集細胞懸浮液，置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化的結(jié)膜上皮細胞，將其調(diào)整為1×104個/mL，在6孔Transwell培養(yǎng)板insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細胞懸液飼養(yǎng)細胞組為實驗組，對照組insert池中無飼養(yǎng)細胞，僅為相同體積的上皮細胞培養(yǎng)液。

1.2.2表皮干細胞的分離、篩選、培養(yǎng)取無菌手術(shù)獲得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L兩性霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液浸泡30min，無菌超凈臺剪除皮下組織，并剪成2mm×4mm皮條，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃過夜。次日用眼科鑷撕取表皮皮片，D-Hank’s液沖洗3次，并用眼科顯微剪將其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使細胞脫落，加入上皮細胞培養(yǎng)液中止消化，200目細胞篩過濾得細胞懸液，收集細胞懸浮液置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化所得的皮膚上皮細胞。將其以1×106個/mL密度接種于Ⅳ型膠原（100μg/mL）鋪底的培養(yǎng)瓶置于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中待細胞貼壁20min后，去除未貼壁細胞，加入新的上皮細胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2d換液一次。

1.2.3表皮干細胞與結(jié)膜上皮細胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化取1～2代表皮干細胞作為實驗細胞，以5×106個/mL接種于6孔Transwell培養(yǎng)板中，實驗組insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細胞（細胞濃度為1×104個/mL）作為飼養(yǎng)細胞；對照組insert池中僅為相同體積的上皮細胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、3、5、7d后，棄細胞培養(yǎng)液，分別取對照組和實驗組細胞提取RNA，進行實時定量RT-PCR檢測目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表達情況。

1.2.4細胞總RNA的提取吸出6孔Transwell培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入1mL TRIZOLreg; Reagent，振蕩混勻，15～30℃溫育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振蕩15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃離心樣品15min（＜12 000g），將上層水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃離心（＜12 000g），棄上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗滌，振蕩樣品，然后7 500g離心樣品5min（如果用來富集小分子RNA，則不用75%乙醇洗滌，直接進入下一步），空氣干燥RNA 10min，用適量RNase free水溶解，于60℃溫育10min，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5引物的構(gòu)建按照參考文獻[4]構(gòu)建設(shè)計：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。

1.2.6PCR擴增取3μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，根據(jù)試驗?zāi)康募尤胂鄳?yīng)的正向引物和反向引物。PCR反應(yīng)總體系為20μL。條件為95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30個循環(huán)；72℃ 10min，1個循環(huán)。

1.2.7熒光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書進行。取1μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，20μL反應(yīng)體系，引物濃度為10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用雙蒸水補平至20μL。反應(yīng)程序為94℃ 10s，1個循環(huán)；94℃ 5s，58℃ 31s，讀板，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT方法。

2結(jié)果

Realtime RT-PCR的結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果可見實驗組表皮干細胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表達明顯上調(diào)，分別為（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表達上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。與對照組相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表達都有顯著性上調(diào)。

圖1表皮干細胞中β2-微球蛋白mRNA的表達水平5d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調(diào)（300±26）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調(diào)（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6

圖2表皮干細胞中CK13 mRNA的表達水平5d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調(diào)（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6

3討論

角蛋白（keratin）是上皮細胞中特異性的中間絲成分。已知的細胞中表達的各種角蛋白家族亞單位成員具有組織特異性，并且和細胞的分化相關(guān)[5]。例如：Krenzer等[6]報道：在正常結(jié)膜上皮細胞中表達角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究報道：通過對38例正常結(jié)膜組織的上皮細胞建立的cDNA文庫，檢測出角蛋白K13是結(jié)膜細胞轉(zhuǎn)錄中表達最豐富的基因，且該基因與細胞骨架的合成有關(guān)，并認為K13有可能是有關(guān)眼表結(jié)膜細胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也證明：在結(jié)膜上皮細胞的免疫組化鑒定中結(jié)膜上皮細胞可被特異性角蛋白K13抗體標記，而在皮膚干細胞中并無相應(yīng)抗體的表達[8]。

β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。雖然有關(guān)該種蛋白的功能尚未明確，但是該蛋白存在于淚液中并可能來源于結(jié)膜上皮細胞中。并且在正常狀態(tài)下淚液中的β2-微球蛋白濃度明顯高于炎癥時淚液中濃度。Dota等[7]研究中也同時檢測到β2-微球蛋白也是結(jié)膜上皮細胞轉(zhuǎn)錄較高的基因，因此本研究將CK13和β2-微球蛋白作為結(jié)膜上皮細胞標記性（特異性）的高效表達基因。

近年來，相關(guān)文獻[9-11]報告了通過組織工程技術(shù)將成體干細胞體外合成生物替代品，并對其組織功能改良用于眼表重建的臨床治療新技術(shù)。然而，成功的眼表重建依賴于兩個重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干細胞；其二，干細胞的載體組織。本研究中應(yīng)用具有高分化、高增殖能力的表皮干細胞為種子細胞，從而保證眼表重建治療中能獲得可靠的細胞源。我們早期的相關(guān)研究中[4]報告應(yīng)用同源異體的結(jié)膜去細胞基質(zhì)膜為干細胞載體膜，不僅可保證具有良好的組織相容性，而且也確保在體外模擬形成結(jié)膜上皮細胞增殖的組織微環(huán)境。從而誘導(dǎo)表皮干細胞定向分化、增殖。

研究結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)分化的表皮干細胞在短時間內(nèi)具有結(jié)膜上皮細胞的特異性基因CK13及β2-微球蛋白的高表達，提示該實驗方法可誘導(dǎo)表皮干細胞形成特異性短暫擴增細胞（TAC），并能定向分化為類結(jié)膜上皮細胞。因此，在臨床上眼表重建的干細胞療法應(yīng)用中，該方法不僅可保證獲得充足的目的細胞來源，而且確保目的細胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。在眼表結(jié)膜組織的重建及生理功能恢復(fù)的臨床治療中提供有效的組織來源。但是，該研究方法中誘導(dǎo)分化的表皮干細胞作為種子細胞能否合成人工結(jié)膜生物膜活體動物眼表的存活狀況及生理功能重塑方面的問題，還需要進一步的研究探索。

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（收稿日期：2011-08-19）