清斑膠囊對ICR鼠皮膚色素生成及抗氧化作用的實驗研究

[摘要]目的：探討清斑膠囊對黃體酮誘導的孕期全身色素加深小鼠血液和肝臟中的SOD、MDA、GSH的影響，以及對小鼠皮膚組織黑色素的影響。方法：制備黃體酮體內(nèi)注射誘導小鼠全身色素加深模型，給藥治療后采用SOD、MDA、GSH試劑盒檢測血清和肝臟中相關指標的變化；體外觀察清斑膠囊對酪氨酸酶活性影響；免疫組化法觀察對小鼠皮膚組織黑色素的影響。結(jié)果：清斑膠囊低中高三劑量組可以明顯提高SOD、GSH活力，降低MDA含量；體外實驗表明，清斑膠囊明顯抑制酪氨酸酶活性，有效抑制皮膚組織黑色素的形成。結(jié)論：清斑膠囊具有良好的抗氧化作用及抑制小鼠皮膚黑素生成的作用。

[關鍵詞]清斑膠囊；黃褐斑；抗氧化；黑色素

[中圖分類號]Q591R332[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）10-1569-03

Experimental research of Qing-ban cupsule on the pigment formation of ICR mouse and the ablity of anti-oxidation

HUANG Kai-fei1，2，WANG Mei-lan1，YANG Hui1，ZHANG Guo-dong1，XU Guang-hui1，HUANG Yi-qi1

（1.Xiamen Medicine Research Institute，Xiamen 361008，F(xiàn)ujian，China；2.Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou362021，F(xiàn)ujian，China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of SOD，MDA，GSH in blood and liver on pigments-enhanced model induced by progesterone， as well as the impact of mouse skin melanoma after treated with Qing-ban cupsule.MethodsPrepare pigments-enhanced mice model induced by progesterone in vitro.SOD，MDA，GSH were detected by kit in serum and liver after drug treatment.The effects on tyrosinase activity were observed after drug treatment. Immuno-histochemistry was used to observe the effects of melanin in mouse skin tissue after drug treatment.Results Qing-ban capsule could significantly improve the SOD，GSH activity and decrease MDA content. In vitro experiment showed that the capsule significantly improved the activity of tyrosinase， inhibited the formation of melanin in skin tissue.ConclusionQing-ban capsule had good anti-oxidation activity and good treatment on skin melanogenesis.

Key words:Qing-ban capsule; chloasma; anti-oxidation; melanin

黃褐斑是一種發(fā)生于面部的慢性難治性色素沉著性皮膚病。雖然針對該病的研究較多，但對其發(fā)病原因和病變機制的研究至今未取得實質(zhì)性進展，且缺乏理想的療法[1]。尋找更為有效的、低毒的祛斑藥物成為廣大科研工作者迫切的任務，中醫(yī)美容學以傳統(tǒng)醫(yī)學理論為指導，采用多種多樣的方法，在數(shù)千年間積累了豐富而寶貴的經(jīng)驗[2]。

清斑膠囊是本所自行研制的以大豆異黃酮、VC、VE、白芷、川芎、當歸為主要原料的復方制劑。為探討其抗黃褐斑作用機理，本研究以黃體酮攻擊小鼠為實驗動物模型，觀察清斑膠囊抗氧化作用與治療色素沉著之間的關系。

1材料

1.1動物：小白鼠（Institute of Cancer Research，ICR），雌性，購自廈門大學實驗動物中心。

1.2儀器：UV-2501PC紫外分光光度計（日本島津）；MK3自動酶標分析儀（芬蘭Multiskan公司）；BL310電子天平（德國Sartorias公司）；CM1900切片機（德國 leica），正置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3藥品與試劑：大豆異黃酮、VE、VC等購自鄭州荔諾生物科技有限公司；白芷、川芎、當歸購自廈門鷺燕醫(yī)藥公司；SOD、MDA、GSH-PX試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；酪氨酸酶、多巴（Sigma公司）；鼠抗人單克隆抗體HMB45、DAB、酶標羊抗鼠二抗(福建邁新生物科技有限公司)。

2方法

2.1實驗動物分組：將篩選合格的小鼠隨機分成5組，每組10只：①A組：空白對照組；②B組：模型對照組；③C組：治療低劑量組（60kg質(zhì)量人單位劑量的5倍）；④D組：治療中劑量組（60kg質(zhì)量人單位劑量的10倍）；⑤E組：治療高劑量組（60kg質(zhì)量人單位劑量的20倍）。

2.2動物模型制備：采用雌激素全身攻擊法[3]，20 mg·kg-1黃體酮注射雌性小鼠大腿根部，每日一次，每周六次兩側(cè)交替，共30天。本研究采用邊造模邊灌胃給藥，觀察清斑膠囊對黃褐斑的預防作用。

2.3 給藥方法：給藥均為灌胃方式。A、B兩組動物給予生理鹽水；C、D、E組實驗動物分別給予相應濃度的復方制劑，將以上每種組分進行灌胃治療4周。

2.4 SOD、MDA、GSH的檢測：小鼠眼球采血后離心制備血清，取小鼠肝臟剪碎、倒入勻漿器制備肝勻漿，用生理鹽水溶解后4000r·min-1的速度離心10min，取上清液，按SOD、MDA、GSH試劑盒說明書嚴格操作，對小鼠血清和肝臟進行相關指標測定。

2.5形態(tài)學觀察：取小鼠皮膚組織標本1.0cm×1.0cm，固定后的皮膚組織進行石蠟包埋后，切成4μm厚的石蠟切片，采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復后，置室溫冷卻。滴加50～100ml工作液于組織上，4 ℃過夜。PBS沖洗切片，將切片置于PBS緩沖液中，浸泡5min，3 次，取出切片，滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1% BSA-PBS稀釋），室溫孵育30min。用PBS沖洗切片。將切片置于PBS緩沖液中，浸泡5min，3次，取出切片，滴加預備好的顯色劑DAB工作液60ml，室溫孵育5～20min，顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色。正常小鼠作為陰性對照，模型組小鼠作為陽性對照，染色好的切片于顯微鏡下觀察、拍照。

2.6酪氨酸酶活性測定方法：采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法檢測酪氨酸酶活性。反應混合物2ml：0.1mol·L-1、pH6.5 、PBS 1.9ml+藥物0.1ml(質(zhì)量濃度0.1g·ml-1）。37℃孵育10min，加0.15% DL-多巴1ml，充分反應后，用分光光度計測定吸光度（A475）值。以PBS液為空白，不加藥物的反應組為對照，實驗每一濃度設3個復管，實驗重復3次，取平均值，分別測定酪氨酸酶活性。

2.7統(tǒng)計學處理：統(tǒng)計結(jié)果以x±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)兩兩比較采用t檢驗，多組之間比較用ANOVA進行。

3結(jié)果

3.1 清斑膠囊對黃體酮誘導的皮膚色素沉著模型小鼠血清和肝臟中SOD、MDA、GSH含量的影響：小鼠模型組血清中SOD、GSH活性明顯降低、MDA增加，低、中、高三個劑量組分別給藥后，與模型對照組相比，給藥組均表現(xiàn)出明顯改善作用，其中中、高劑量組與模型組比較差異顯著（P＜0.05），且具有劑量依賴效應（見表1），同時清斑膠囊可以明顯升高小鼠肝臟的SOD，降低MDA水平，具有顯著性差異（見表2）。

3.2 清斑膠囊對皮膚色素沉著模型小鼠皮膚黑色素的影響：正常對照組表皮中未見黑素細胞表達，毛囊及皮脂腺基底細胞中可見少量黑素細胞，且著色較淺，呈現(xiàn)淺黃色。模型組黑素細胞陽性表達明顯增多，分布于毛囊基底細胞中，著色較深，染色成黃褐色。清斑膠囊高、中、低劑量組可以明顯減少黑素細胞的表達（見圖1）。

3.3清斑膠囊對酪氨酸酶活性的影響：不同濃度清斑膠囊對酪氨酸酶活性有顯著抑制作用，各濃度之間又以高濃度的作用最強，與模型組比較差異顯著。以上說明清斑膠囊良好的治療作用與其對酪氨酸酶的抑制作用相關，且存在量效關系（見表3）。

4討論

黃褐斑形成機理極為復雜，影響因素很多，黑素產(chǎn)生過多沉積于皮膚是其結(jié)果，且多發(fā)于中青年女性面部皮膚[4-5]。文獻報道隨年齡增長，機體內(nèi)抗氧化能力下降，自由基水平增加[6]，成為導致黃褐斑的主要原因之一；近年來有研究表明，酪氨酸酶在黃褐斑的發(fā)生、發(fā)展過程中同樣起著重要作用，決定皮膚顏色的色素主要為黑色素，黑色素產(chǎn)生于表皮基底層的黑色素細胞內(nèi)，由酪氨酸經(jīng)含銅的酪氨酸酶的羥基化作用后形成多巴，再經(jīng)氧化而形成[7]，抑制酪氨酸酶活性可以改善黃褐斑的形成。

目前治療黃褐斑主要從抑制黑素細胞活性及增殖、防止黑素形成及抗氧化等方面入手，同時盡量避免和減少誘因[8]。中藥治療黃褐斑的作用是多靶點的，而黃褐斑上午發(fā)病也涉及多因素、多環(huán)節(jié)，可見中醫(yī)藥治療該病具有廣闊的研究前景[9]。同時中西醫(yī)藥物結(jié)合治療黃褐斑亦逐年增多，臨床多用以中醫(yī)為主的中西醫(yī)結(jié)合療法[10]。

本復方從中西醫(yī)兩種理論角度出發(fā)，選取大豆異黃酮、白芷、VC、VE、當歸、川芎組合而成，結(jié)果顯示該復方能明顯提高小鼠黃褐斑模型血清和肝臟中SOD、GSH的活性，降低MDA含量。同時明顯降低黑素細胞的表達以及能在體外顯著抑制酪氨酸酶活性。

綜上研究表明，本復方具有良好的治療黃褐斑功效，其治療黃褐斑的機制可能與提高機體抗氧化能力以及抑制酪氨酸酶活性，進而阻斷了黑素的形成有關。

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[收稿日期]2011-06-23 [修回日期]2011-08-19

編輯/張惠娟