血細胞源性TFmRNA及血漿Fib水平與肢體動靜脈血栓的研究

作者單位：350001 福建醫科大學省立臨床醫學院

通訊作者：陳群

【摘要】 目的 研究肢體動靜脈血栓患者體內血細胞源性組織因子（TF）mRNA的表達及血漿Fib水平。方法 采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法對動脈血栓組、靜脈血栓組患者及對照組成員外周血血細胞組織因子進行檢測，并用全自動血凝儀分析血漿Fib水平。結果 動脈血栓組、靜脈血栓組TF mRNA水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；動靜脈血栓組血漿Fib水平較對照組明顯增高，差異有統計學意義。結論 血細胞源性TF mRNA、血漿Fib在肢體動靜脈血栓患者外周血中顯著增高。

【關鍵詞】 血細胞； TFmRNA； Fib； 肢體動靜脈血栓

Study of bloodcell TFmRNA and plasma Fib level in patients with arterious or venous thrombus LIU Yu-cheng，CHEN Qun， SHEN Xiao-li.Provincial Clinical Colleage of Fujian Medical Univercity，Fuzhou 350001，China

【Abstract】 Objective To investigate bloodcell TFmRNA and plasma Fib level in patients with arterious or venous thrombus.Methods Detect the bloodcell TFmRNA of the patients with arterious or venous thrombus and control group by means of RT-PCR and analyze the plasma Fib level for them by full automatici-coagulometer.Results The expression of TFmRNA in the blood of the patients with arterious or venous thrombus were significant higher than that of the control group（P<0.05）; the plasma Fib level in patients with arterious or venous thrombus were significant higher than that of the control group too.Conclusion Bloodcell TFmRNA and plasma Fib level were extremly high in the peripheral blood of the patients with arterious or venous thrombus.

【Key words】 Bloodcells; TFmRNA; Fib; Membra thrombus

組織因子（TF）是一種跨膜糖蛋白，通過與凝血因子Ⅶ相互作用參與凝血過程，在動靜脈血栓形成過程中起重要作用。另外，TF通過介導多種信號轉導，參與腫瘤侵襲、轉移，血管新生，動脈粥樣硬化，炎癥等病理、生理過程^［1］。人組織因子可位于各種正常的組織細胞、血管內皮、血管壁及循環血中。而循環血中TF主要來源于血細胞。經典凝血學說認為，只有在血管壁破損時，內膜下TF暴露、釋放才能啟動凝血及血栓形成^［2］。而對循環血中組織因子與血栓關系的研究較少。血漿Fib增高是血栓形成的一個危險因素，血栓患者血漿Fib含量往往升高。本研究就循環中血細胞內的TF及其內TFmRNA表達和血漿Fib水平與肢體動靜脈血栓關系進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年12月～2010年12月福建省立醫院住院，經動、靜脈造影確診的肢體動、靜脈血栓患者60例，其中動脈血栓組30例，靜脈血栓組30例。另外，選取同期于本院體檢的30例健康者作為對照組。所有入選患者的性別、年齡、血壓、血小板、血糖及血脂構成比均無統計學意義，具有可比性。

1.2 入選標準及排除標準 入選標準：參照1995年中國中西醫結合學會周圍血管疾病專業委員會制定的診斷標準。排除標準：腫瘤、嚴重感染、DIC、嚴重腎衰、腦梗腦血栓、代謝性疾病及其它免疫性疾病患者。

1.3 方法 （1）采血：清晨用肝素鋰真空采血管采取肘前靜脈血5 ml，反復顛倒采血管數次。（2）去除紅細胞：采取血標本2500 r/min離心后，去上清，加入紅細胞裂解液進行紅細胞裂解，洗滌、分離所需血細胞（白細胞、血小板）。（4）引物由上海生工生物工程有限公司合成。（5）提取總RNA：按照說明書，trizol一步法提取血細胞總RNA。（6）逆轉錄：RT試劑盒購自promega公司，按試劑盒說明進行逆轉錄，得到cDNA。（7）PCR反應：取cDNA產物1 μl，10 mM上下游引物各1 μl，2×Master Mix 12.5 μl，加水至25 μl，反應體系置PCR儀中進行擴增。（8）凝膠電泳分析、半定量分析。（9）STAGO STA全自動血凝儀檢測血漿Fib水平。

1.4 統計學處理 所有實驗數據均應用SPSS 13.0軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差（ x±s）表示，兩組均數比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動靜脈血栓組TFmRNA表達情況 通過RT-PCR反應，DNA片段電泳，根據maker觀察TF片段及GADPH片段大小分別為283 bp、400 bp。與對照組相比，動靜脈血栓組TFmRNA表達量顯著升高，差異具有統計學意義，見表1。

表1 三組血細胞內TFmRNA表達水平比較

注：與對照組相比，^*P<0.05

2.2 血漿Fib水平 采取肘靜脈血5 ml，離心，收集上層血漿，用法國STAGO STA全自動血凝儀對血漿Fib水平進行檢測，結果見表2。

表2 三組血漿Fib水平比較

注：與對照組相比，^*P<0.05

3 討論

在體內，生理性止血與血栓形成的凝血過程幾乎都是通過組織因子（TF）與FVIIa形成復合物而啟動的。因此，對TF的研究已成醫學科研的熱點^［3］。傳統的凝血學說認為，只有在血管內皮細胞破壞、受損的情況下，內皮下、血管平滑肌層及血管外膜的組織因子暴露，與FVIIa結合啟動生理性凝血或病理性血栓形成^［4］。近來有學者實驗證實，血液循環中的組織因子，幾乎全部來自于血細胞，且主要以白細胞為主，在血栓的啟動、形成及延續階段起著至關重要的作用^［5］。本研究以血栓患者及對照組成員靜脈血血細胞為研究對象，從mRNA水平研究TF的表達情況。

國內外研究表明，TF表達與血栓性疾病關系密切。Blann等^［6］研究發現，外周動脈血栓患者血漿中組織因子水平較對照組升高。大量報道證實，冠狀動脈粥樣硬化患者較健康對照組同樣具有組織因子表達上升。國內外對TF與冠心病血栓形成的研究較多，研究發現，在血管內皮細胞、單核細胞和平滑肌細胞等動脈粥樣硬化斑塊中的這些主要細胞成分都能合成TF，這些TF一方面與平滑肌表面VIIa因子結合，激活ERK1（2）通路，從而引起血管重構；另一方面，TF有促進動脈粥樣斑塊內血管生成，使得斑塊不穩定性增加，破裂脫落后導致更多的TF釋放入血，引發血栓形成。且不穩定性心絞痛患者TF血漿水平要高于穩定性心絞痛患者，這就為TF在肢體動脈硬化患者中表達增高并促進血栓形成提供了有力的依據。Yuko Kamikura等^［7］研究表明，靜脈血栓形成患者，白細胞組織因子mRNA表達較健康自愿者升高，靜脈血栓合并癌癥或DIC患者，mRNA表達升高更加明顯，同時，靜脈血栓患者血漿中TF抗原水平顯著升高。血細胞表達或血漿中TF水平增高原因主要有：（1）動脈粥樣斑塊破裂，斑塊內TF釋放及內皮下TF暴露、釋放入血；（2）促炎癥因子、凝血酶、內毒素、LDL、CRP等對血細胞，其中主要為單核細胞的誘導性表達。另外，單核細胞通過與內皮細胞、血小板及血管平滑肌細胞相互作用，促使其表達上調；（3）某些嚴重疾病，特別是嚴重感染、實體癌、造血系統腫瘤等^［8］。本研究在排除嚴重感染，腫瘤等疾病的情況下，發現血栓患者血細胞組織因子mRNA表達較對照組明顯增高，差別有統計學意義，表明血細胞高表達TF與血栓性疾病發生相關。而動靜脈組之間比較，差別則無統計學意義（P0.166）。Nigel Mackman等^［9］人指出，由于靜脈血栓患者血管壁往往是完整的，因此MP TF（血細胞來源）在血栓形成中占主導地位，而動脈血栓形成中，斑塊中TF起主要啟動作用，MPTF只是在血栓延續過程中起作用。這也說明，血細胞TF表達增高在血栓形成中起著重要作用，并與血栓性疾病密切相關。

血漿纖維蛋白原（Fib）是血凝檢測的篩選指標，也是血栓性疾病臨床治療效果的評估指標。血漿纖維蛋白原含量與血栓形成、粥樣斑塊破裂發生率成正比^［10］。Renner等^［11］認為，血漿Fib水平與深靜脈血栓發生的危險性具有相關性。本研究無論動脈血栓還是靜脈血栓組，血漿Fib水平均較健康對照組高，差異具統計學意義。但動靜脈血栓組之間Fib水平差異則無統計學意義（P0.509）。

目前對血栓患者主要采取抗凝，抗血小板及溶栓治療。本研究結果顯示，血栓組血細胞內TF表達顯著增高，說明血細胞性TF與肢體動靜脈血栓疾病相關。另外，鑒于TF在動靜脈血栓形成的過程及機制的不同，選擇性使用抗TF藥物，并結合抗血小板、溶栓等其它抗血栓治療，能起到較為滿意的治療效果。目前對血細胞源性TF在血栓形成中的具體作用機制有待于進一步研究完善，這將為今后抗血栓治療提供一條新的思路。

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（收稿日期：2011-03-28）

（本文編輯：王春蕓）