LGT模型鼠血清及其癌組織提取液中蛋白質指紋比較研究

作者單位：030013 山西省腫瘤醫院（陳妍，裴毅）；山西省忻州市人民醫院（杜秀玉）

通訊作者：裴毅

【摘要】 目的 分析比較LGT模型鼠血清與其腫瘤組織中危重患者預警（LGT-Lost Goodwill Target）蛋白指紋的表達特征。方法 取4～5周齡雌性小鼠1只，接種S180腫瘤細胞懸液（0.2 ml/只），建立小鼠S180肉瘤動物模型。腫瘤細胞株S180以腹水瘤形式在昆明（KM）小鼠體內傳代，傳代后第8天，無菌條件下抽取腹水并以生理鹽水稀釋，調整細胞密度 2×10⁷/ml，制成腫瘤懸液，置于冰浴備用。將制備好的腫瘤細胞懸液以每只0.2 ml于昆明小鼠（10只）右腋下的皮下接種造模。建立小鼠S180肉瘤動物模型。隨機分為造模組（A組，5只）及對照組（B組，5只），腫瘤長至0.5 cm大小時，開始給予造模組（A組）腹腔注射順鉑5.2 mg/kg，連用4 d；同天給予空白對照組（B組）腹腔注射等計量生理鹽水，連用4 d。于造模結束后第3天兩組小鼠全部摘眼球取血，分離血清進SELDI 檢測，解剖造模組小鼠，分別取瘤組織、瘤旁組織及正常組織各1 g，勻漿，抽取上清液行SELDI檢查。并利用Biomarker Wizard 軟件對各組血清及瘤組織、瘤旁組織及正常組織勻漿液的蛋白質組指紋圖譜進行比較分析。結果 （1）A組血清LGT蛋白質組指紋陽性，B組血清LGT蛋白質指紋陰性。造模成功，A組可行進一步分析。（2）A組血清與癌組織液LGT相關蛋白質指紋圖譜：有8個蛋白質差異有統計學意義（P<0.05）。其m/z分別為1993、2009、2028、2217、2502、8696、9940、10145。（3）A組血清與癌旁組織液LGT相關蛋白質指紋圖譜：有7個蛋白質差異有統計學意義（P<0.05）。其m/z分別為1077、1211、1994、2009、2030、2081、11 817。（4）A組血清與正常組織液LGT相關蛋白質指紋圖譜：有5個蛋白質差異有統計學意義（P<0.05）。其m/z分別為1004、1994、2010、2030、2217。結論 本結論認為造成腫瘤惡化而導致死亡發生的因素極有可能不單獨在腫瘤本身，而在于周圍環境。各個部位所表達的蛋白質指紋也不一致，可以是因各組織蛋白質代謝不同所致。但其與LGT的關系有待進一步研究。

【關鍵詞】 模型鼠； SELDI技術； LGT

The comparative analysis of the LGT protein fingerprints in model rat serum and cancerous tissue in model rat CHEN Yan， DU Xiu-yu，PEI Yi.Shanxi Tumor Hospital，Taiyuan 030013，China

【Abstract】 Objective To analyze and compare LGT model rat serum and tumor tissue LGT（LGT-Lost Goodwill Target）protein expression of fingerprint characteristics.Methods Take 4-5 weeks female mice 1 only，a mouse model was developed by inoculating S180 cells directly into KM mice.Tumor cell S180 with ascites tumor form in kunming （KM） mice nestin， the first eight days， after nestin under aseptic conditions and to extract ascites， adjust the diluted saline cell density 2×10⁷/ml， make tumor levitation liquid， on the ice bath. Set aside. Will preparation good tumor cell suspension liquid per only 0.2 ml in Kunming mice （10） only right armpit subcutaneous inoculation made moulds. All the mice were divided into 2 groups. When the tumor long to 0.5 cm big hours ，group A was injected cisplatin 5.2 mg/（kg·d） for 4 days by intraperitoneal injection. Group B was control groups for 4 days by with group A of intraperitoneal injection with days such as measuring saline 4 days. The mice were killed at the fourth day after chemotherapy end. Then we collected the eyeball blood samples， and SELDI was applicated to test it. Made of module mice anatomy， were taken tumor tissue， peritumoral organization and normal tissue 1g each， use electric homogenate device homogenate， extraction supernatant fluid lines SELDI inspection. Respective proteomic fingerprint was analyzed by Biomarker Wizard software to discover the different proteomic fingerprints.Results （1）Group A serum LGT proteome fingerprint is positive， group B LGT serum protein fingerprint negative.（2）Group A serum protein with cancer organization fingerprint: In the detection of protein fingerprint: there are 9 protein difference was statistically significant （P<0.05）. Differences protein fingerprint m/z respectively：1993，2009，1028，2217，2502，2545，8696，9940，10145.（3）Group A serum protein with peritumoral organization fingerprint： In the detection of protein fingerprint: there are 7 protein difference was statistically significant （P<0.05）. Differences protein fingerprint m/z respectively：1077，1211，1994，2009，2030，2081，11817.（4）Group A serum protein with normal tissue fingerprint： In the detection of protein fingerprint: there are 5 protein difference was statistically significant （P<0.05）.Differences protein fingerprint m/z respectively：1004，1994，2010，2030，2217.Conclusion This conclusion is caused by tumor progression and cause death occurred factors likely not tumor itself， in your surroundings. Each place of expression protein fingerprints are not uniform， its and LGT relationship and significance to research further.

【Key words】 Model rat; SELDI-TOF-MS; LGT-Lost Goodwill Target

人類腫瘤蛋白質組的研究是目前惡性腫瘤研究的重要方法之一。裴毅等^［1］于2004年應用SELDI技術從146例腫瘤患者在不同腫瘤情況下、不同病情發展階段的動態血清蛋白質組的質譜中，捕捉到了一組促進腫瘤患者病情惡化的異常蛋白質組^［2］，2005年通過省科技鑒定，認為蛋白質指紋是一個原創發現^［3］。用SELDI證實該蛋白質指紋對腫瘤患者的病情演變和死亡發生有預警作用^［4］。2007年完成表達LGT蛋白質動物模型的構建（鑒定專利：200710087535.7），證明了該蛋白質的存在^［5］。

危重病人預警（LGT-Lost Goodwill Target）蛋白指紋模型鼠組及空白對照組，經SELDI技術分別檢測小鼠的血清，造模組血清LGT蛋白質組指紋陽性，空白對照組血清LGT蛋白質指紋陰性。進一步對造模組小鼠瘤組織、瘤旁組織及正常組織勻漿后，勻漿液行SELDI檢查，觀察各組LGT蛋白質組指紋，并就其相關性進行比較。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 瘤源 S180肉瘤瘤株，由中國藥品制品鑒定所引進。

1.1.2 實驗動物 4～5周齡雌性昆明種（KM）小鼠，共10只，體重為19～22 g，購自于山西省腫瘤醫院研究院動物實驗室。

1.1.3 試劑和儀器 三氟乙酸、SPA、CHAPS、乙腈、尿素、Tris-HCI。ProteinChip Bioloy System（PBS）質譜儀、弱陽離子交換型（CM10）蛋白質芯片均購自Ciphergen Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 接種造模 取4～5周齡雌性小鼠1只，接種S180腫瘤細胞懸液（0.2 ml/只），建立小鼠S180肉瘤動物模型。腫瘤細胞株S180以腹水瘤形式在昆明（KM）小鼠體內傳代，傳代后第8天，無菌條件下抽取腹水并以生理鹽水稀釋，調整細胞密度 2×10⁷/ml，制成腫瘤懸液，置于冰浴備用。將制備好的腫瘤細胞懸液以每只0.2 ml于昆明小鼠（10只）右腋下的皮下接種造模。

1.2.2 分組及給藥方法 接種24 h后隨機分組。分為兩組：A組造模組（n5），腹腔注射順鉑5.2 mg/kg，連用4 d；B組空白對照組（n5），腹腔注射等計量生理鹽水，連用4 d。

1.2.3 樣品收集 于造模結束后第3天兩組全部給予小鼠摘眼球取血分離血清進SELDI 檢測，對造模組小鼠進行解剖，分別取瘤組織、瘤旁組織及正常組織各1 g，按0.5 g組織加入1 ml生理鹽水，用電動勻漿器勻漿，3000 r/min離心5 min分離組織液，抽取上清液行SELDI檢查。并利用Biomarker Wizard 軟件對各組血清及瘤組織、瘤旁組織及正常組織勻漿液的蛋白質組指紋圖譜進行比較分析。

1.2.4 血清樣本的制備 將小鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉，摘眼球取血后，立即放入4 ℃冰箱靜置30 min。隨后4 ℃ 3000 r/min離心5min分離血清，分裝，放入-80 ℃冰箱保存。使用時，冰上融化后，4 ℃ 10000 r/min離心5 min。在標記好的0.5 ml離心管中依次加入10 μl U 9緩沖液和5 μl 血清樣品，并將樣品混勻。稀釋樣品，冰浴振蕩30 min，然后向15 μl稀釋樣品中加入185 μl醋酸鈉緩沖液，用振蕩器混勻。

1.2.5 組織上清液樣本的制備 經SELDI技術分別檢測小鼠的血清，造模組血清LGT蛋白質組指紋陽性，空白對照組血清LGT蛋白質指紋陰性。進一步對造模組小鼠瘤組織、瘤旁組織及正常組織勻漿后，勻漿液行SELDI檢查。對造模組小鼠進行解剖，分別取瘤組織、瘤旁組織及正常組織1 g，將離體組織在半小時內，由專業技術人員行組織勻漿，按0.5 g組織加入1 ml生理鹽水，用乳化勻漿機勻漿，隨后4 ℃ 3000 r/min離心5 min分離組織液，抽取上清液，密封分裝，放入-80 ℃冰箱保存。使用時，冰上融化后，4 ℃ 10000 r/ min離心5 min。在標記好的0.5 ml 離心管中依次加入10 μl U 9緩沖液和5 μl 血清樣品，并將樣品混勻。稀釋樣品，冰浴振蕩30 min，然后向15 μl稀釋樣品中加入185 μl醋酸鈉緩沖液，用振蕩器混勻。

1.2.6 芯片預處理、上樣和洗脫 將CM10芯片安裝于加樣器（bioprocessor） 內，向A-H 加樣孔中加入200 μl 醋酸鈉緩沖液，振蕩5 min（ 600 rpm，室溫），棄去緩沖液，重復上述操作1 次。向加樣孔中加入100 μl 稀釋血清樣品，室溫振蕩孵育1 h（600 rpm，4 ℃）。棄去未結合樣品，每孔加入200 μl 醋酸鈉緩沖液，振蕩5 min（ 600 rpm，室溫），棄去緩沖液后，重復上述操作1 次。每孔加入200 μl清水（純度HPLC級），重搖10次，立刻棄去。待芯片表面自然晾干后，每點各加飽和SPA 2次，每次1 μl，兩次點樣之間需待芯片表面風干后再次點樣。自然干燥后，上機檢測。

1.2.7 芯片檢測、數據采集和參數設置 采用PBS-Ⅱc型蛋白芯片閱讀儀讀取芯片信息，用加有All-in-one標準蛋白質的NP20芯片校正儀器，至1%范圍內。芯片閱讀儀參數設置如下：激光強度195，檢測靈敏度8，優化范圍2000～20 000 kDa，最高分子量40 000，芯片上的每個點采集130 次。

1.3 統計學處理 所有數據采用Proteinchip Software 3.11進行統一校正，使總離子強度及分子量達到標準化。再利用Biomarker Wizard軟件進行分析，所得數據以均數±標準差（x±s）表示，比較不同組的血清及癌組織蛋白質含量的P值，當P<0.05表示差異有統計學意義。用數據挖掘軟件Biomarker Pattern Software對數據分組及相關性進行分析，尋找各組之間表達有差異的蛋白質峰。

2 結果

2.1 運用PBSⅡ型蛋白質芯片閱讀儀對各組間血清及組織液特異性蛋白質質譜圖歸類比較 將5例空白對照組、5例造模組，利用PBSⅡ型蛋白質芯片閱讀儀對CM10芯片進行檢測。檢測的蛋白質分子量區間在1000～20 000 Da之間，所得到的蛋白質以波譜的形式表示（見圖1、圖2）。

2.2 運用Biomarker Wizard軟件對各組間血清特異性蛋白質質譜圖歸類比較

2.2.1 比較造模組血清與癌組織液蛋白質指紋圖譜 在檢測出的蛋白質指紋圖譜中：其中有8個蛋白質差異有統計學意義（P<0.05）。按P值由小到大的差異蛋白質峰的m/z分別為1993、2009、2028、2217、2502、8696、9940、10 145。其中與血清組相比，癌組織組有5個質譜峰上調，有3個下調。具體見表1。

表1 造模組血清與癌組織液蛋白質指紋差異

2.2.2 比較造模組血清與癌旁組織液蛋白質指紋圖譜 在檢測出的蛋白質指紋圖譜中：其中有7個蛋白質差異有統計學意義（P<0.05）。按P值由小到大的差異蛋白質峰的m/z分別為1077、1211、1994、2009、2030、2081、11 817。其中與血清組相比，癌旁組織組質譜峰均上調。具體見表2。

表2 造模組血清與癌旁組織液蛋白質指紋差異

2.2.3 比較造模組血清與正常組織液蛋白質指紋圖譜 在檢測出的蛋白質指紋圖譜中：其中有5個蛋白質差異有統計學意義（P<0.05）。按P值由小到大的差異蛋白質峰的m/z分別為1004、1994、2010、2030、2217。其中與血清組相比，正常組織組有3個質譜峰上調，有2個下調。具體見表3。

表3 造模組血清與正常組織液蛋白質指紋差異

2.2.4 比較造模組血清與各組織液蛋白質指紋圖譜 其中位于m/z：11 000+H～12 000+H的各組區分中被作為潛在的生物標記篩選了出來，從血清組、癌旁組織組、癌組織組到正常組織組，各組中的表達依次升高（見表4）：其中以正常組織液中LGT蛋白質相對含量最高，因此位于m/z：11000+H～12000+H的蛋白質在正常組織中為高表達。

表4 各組間各組LGT蛋白質相對含量

3 討論

采用動物模型進行研究，可為進一步的人體研究提供有效的參數。SELDI蛋白芯片技術是目前國內外研究生命蛋白質組指紋學的主要設備之一。本研究是將這兩種技術結合，分析比較動物模型血清與腫瘤組織中危重病人預警蛋白指紋的表達特征及相關指紋的表達特征。以明確該蛋白質是否存在于腫瘤組織中，以及與血清的差別。以腫瘤模型鼠大劑量化療后，經SELDI技術檢測模型鼠的血清，有LGT蛋白質組指紋出現，進一步對該組模型鼠瘤組織、瘤旁組織及正常組織勻漿后，勻漿液行SELDI檢查，觀察各組LGT蛋白質組指紋，并就其相關性進行比較。

前期的研究結果證明，LGT是客觀存在的，是一個促進腫瘤患者病情惡化并導致死亡發生的重要蛋白質組。該蛋白質組可以借助于SELDI技術以指紋的形式進行描述。目前國內外對LGT研究較少，臨床應用不多。通過進一步研究明確LGT指紋的發源地，揭示LGT出現和對機體產生影響的時機，這樣就可為研發阻斷藥物找到靶點^［6］，研發治療藥物，降低死亡率，為深入了解腫瘤的發生及發展過程和患者生前蛋白質組的變化提供科學依據。裴毅等于2007年成功地建立了產生該蛋白質的昆明鼠系動物模型^［5］，并根據流行病學調查分析及臨床應用研究，可以認為LGT蛋白質是客觀存在的，而且其SELDI芯片技術捕獲的LGT蛋白質指紋作為檢驗平臺和抗腫瘤治療療效的判斷，是有臨床價值的^［7］。

研究結果認為，危重病人預警蛋白質（LGT）不僅存在于血清中，還存在于組織、瘤旁組織及正常組織中，所不同的是其含量各不相同，其中兩點最為重要：（1）各組中除LGT豐度含量不一樣外，也表達其他差異蛋白質，說明在腫瘤生長過程中，各組織的其他生命活動依然存在。（2）正常組織中LGT蛋白質相對含量最高，表明腫瘤并不是直接造成機體病情惡化的原因，極有可能環境因素是腫瘤加重并導致死亡的主要原因，尤其是綜合因素。本研究發現的各組織不相同蛋白質指紋，可以認為是因各組織的蛋白質代謝所致，但與LGT有無相關性有待進一步研究。

參考文獻

［1］ 肖雪媛，衛秀平，何大澄.應用蛋白質芯片技術從血清中篩選肺癌標志蛋白.中國科學，2003，33（4）:323-338.

［2］ 裴毅.危重病人預警蛋白質動物模型的構建.國家專利，200710087535.7.

［3］ 王蓉，裴毅.危重病人預警蛋白質組指紋表達與無效化療的相關性研究.現代生物醫學進展，2007，7（12）:1856-1860.

［4］ 裴毅，郭素堂，王清馨，等.一組新發現的腫瘤功能性蛋白質的指紋圖譜.腫瘤研究與臨床，2005，17（3）:153.

［5］ 裴毅.標記惡性腫瘤預后的預警蛋白質組指紋特征的發現及認定.山西省科學技術廳.晉科鑒字［2005］第193號.2005，11.

［6］ Merchant M，Weinberger SR，Recent advancements in surface enhanced laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry.Electrophoresis，2000， 21（6）:1164.

［7］ 鄭國寶，高春芳，趙光.利用蛋白質芯片（SELDI-TOF-MS）研究大腸癌患者血清蛋白特異性標記物//夏家輝.生命科學研究.北京：北京科學出版社，2003：76-80.

（收稿日期：2011-04-28）

（本文編輯：陳丹云）