BRAF基因突變與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究

【摘要】 目的 探討甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中BRAFV600E突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。方法 采用PCR直接測(cè)序法檢測(cè)65例PTC患者腫瘤細(xì)胞DNA中BRAFV600E點(diǎn)突變，分析其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果 BRAFV600E點(diǎn)突變?cè)赑TC中的發(fā)生率為61.5%（40/65），其中40例BRAFV600E突變的PTC中有14例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而未突變的25例患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例，BRAFV600E點(diǎn)突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P=0.7932）。結(jié)論 BRAFV600E可能參與PTC的發(fā)生，但與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 甲狀腺乳頭狀癌； BRAF； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

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甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中PTC占甲狀腺癌的85%~90%。PTC的發(fā)生發(fā)展涉及到多種基因的突變和重組，例如RET/PTC1， RET/PTC3的重排，NRAS突變和P53突變失活。2002年Davie等^［1］報(bào)道在66%的惡性黑色素瘤和一系列其它腫瘤中檢測(cè)到BRAF基因突變，該突變主要見于BRAF基因第11和15外顯子的激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，80% 以上的突變都是第15外顯子位核苷酸上的單堿基顛換，致使其編碼的氨基酸由纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?。隨后在PTC中也檢測(cè)到了BRAFV600E突變，突變率在28%～83% 之間 ^［2~4］。近2年有報(bào)道稱，BRAFV 600E突變的PTC更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但兩者之間的確切關(guān)系仍需要進(jìn)一步的研究證明。因此，筆者檢測(cè)了65例PTC中BRAFV600E突變的突變情況，旨在進(jìn)一步探討B(tài)RAFV600E突變和PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集了65例PTC患者的手術(shù)切除的新鮮組織，由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)生分辨瘤旁的正常組織和腫瘤組織，并立即保存于液氮中。所有病例均由2名以上病理學(xué)教授按照世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并獨(dú)立作出診斷。

1.2 方法

1.2.1 DNA 抽提 所有冰凍組織DNA均采用OMEGA DNA 抽提試劑盒提供的方法進(jìn)行抽提，并采用nanodrop檢測(cè)DNA的完整性和濃度，所有的DNA的OD值都大于1.9。

1.2.2 引物合成 所需擴(kuò)增引物均由上海生工生物工程有限公司合成，BRAF-F：ACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCT，BRAF-R：CTGATTTTTGTGAATACTGGGAACT，擴(kuò)增長(zhǎng)度為318 bp。

1.2.3 PCR反應(yīng) 所用試劑均購于上海申能博彩生物科技有限公司。PCR反應(yīng)體系為20 L終體積，內(nèi)含雙蒸水13.4 L， 10×PCR buffer（含Mg2+）2 L， dNT 200(mmol/L)0.4 L，上下游引物(10 pmol/L)各1 L， Taq 酶(5 u/L) 0.2 L， 模板2.0 L (約100 ng)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 72 ℃ 10 min， 共35個(gè)循環(huán)。每一次實(shí)驗(yàn)都以雙蒸水作為陰性對(duì)照。取PCR產(chǎn)物5 L，2%瓊脂糖凝膠電泳， 溴化乙啶染色， 凝膠成像儀下觀察并照相。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 將PCR 產(chǎn)物送往上海博尚生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序，測(cè)序序列采用PCR前向引物，采用chromos軟件進(jìn)行序列讀取，并將測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST基因服務(wù)網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，以確定有無突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件， 組間比較用χ2 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

本次研究收集了65例PTC患者，其中40例患者的腫瘤組織含有BRAFV600E突變（圖1），突變率為61.2%，而瘤旁的正常組織均無此突變。40例含有BRAFV600E點(diǎn)突變的患者有14例(35%)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，25例未含有該突變的患者有10例(40%)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，該相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.7932）（表1）。

3 討論

不同的研究報(bào)導(dǎo)中BRAFV600E在PTC中的突變率不盡相同，從28％～83％不等，主要與不同地域及民族背景等流行病學(xué)因素有關(guān)。此外，有學(xué)者認(rèn)為可能與PTC的亞型分布有關(guān)，經(jīng)典型PTC、濾泡亞型PTC和甲狀腺濾泡狀癌（FTC）組織的BRAF V600E突變率分別為51％、24.1％和1.4％。本實(shí)驗(yàn)共收集65例PTC患者，突變率為61.5%。Sitham andam^［5］和Mercer等^［6］證實(shí)，BRAF基因?yàn)镸APK通路中最強(qiáng)的活化因子，將BRAF突變體轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)化效率比野生型BRAF增強(qiáng)了70～138倍，從而更加支持BRAF突變可能通過RAS/RAF/MEK/MAPK通路致癌的機(jī)制。Knauf等^［7］通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因鼠甲狀腺細(xì)胞發(fā)生BRAFV600E突變而引發(fā)PTC形成的實(shí)驗(yàn)也充分說明了這一點(diǎn)。

Kebebw等^［8］回顧分析314例分化型甲狀腺癌的臨床病理資料，報(bào)道了典型PTC BRAFV600E基因突變與多種因素有關(guān)，包括患者年齡大、有頸部淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期高(Ⅲ～Ⅳ期)，術(shù)后有癌組織殘留和復(fù)發(fā)(平均隨訪6年)。故認(rèn)為BRAF V600E突變與甲狀腺癌的侵襲性表型(aggressive phenotype)有關(guān)聯(lián)，典型PTC中BRAF V600E突變基因型的術(shù)后癌組織殘留和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。而多因素分析揭示，只有BRAF V600E突變和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是典型PTC術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，BRAF V600E突變基因型診斷對(duì)選擇擴(kuò)大手術(shù)切除和減少PTC的術(shù)后病灶殘留和復(fù)發(fā)有指導(dǎo)價(jià)值。Xing等^［9］的219例多中心研究資料揭示，初次手術(shù)時(shí)癌已侵犯甲狀腺周圍組織、有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺癌已處于進(jìn)展期(Ⅲ～Ⅳ期)都與PTC的BRAF基因突變有顯著相關(guān)性。術(shù)后隨訪(平均15個(gè)月)揭示BRAF基因突變型(V600E)比野生型PTC的復(fù)發(fā)率高(25％VS 9％)，即使是Ⅰ～Ⅱ期腫瘤BRAF基因突變型的復(fù)發(fā)率也明顯高(22％VS 5％)。故認(rèn)為檢測(cè)PTC的BRAF V600E基因突變可輔助預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Kim等^［10］也報(bào)道檢測(cè)原發(fā)灶的BRAF V600E基因突變可預(yù)測(cè)PTC的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且其預(yù)測(cè)價(jià)值較患者年齡、腫瘤臨床分期、病灶大小等臨床病理因素的預(yù)測(cè)價(jià)值高。Elisei等^［11］術(shù)后隨訪15年揭示BRAF V600E是預(yù)后較差的唯一獨(dú)立因素。本實(shí)驗(yàn)在65例患者當(dāng)中發(fā)現(xiàn)該突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性，這可能與患者數(shù)量的有限性和沒有長(zhǎng)期隨訪相關(guān)。所以本實(shí)驗(yàn)在繼續(xù)隨訪同時(shí)擴(kuò)大患者數(shù)量以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為臨床醫(yī)生提供理解和治療甲狀腺乳頭狀癌的理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2011-08-23）

（本文編輯：車艷）