RNA干擾Grp78蛋白對肺癌細胞A549的作用研究

【摘要】 目的 探討采用RNA干擾Grp78蛋白表達，觀察對肺癌細胞A549的作用。方法 通過轉染Grp78的siRNA質粒到肺癌細胞A549并進行表達，觀察A549細胞的Grp78蛋白的表達及細胞的侵襲和轉移能力的變化。結果 RNA干擾肺癌細胞A549的Grp78的表達，能夠顯著地抑制癌細胞的黏附、伸展，以及MMP-2，MMP-9蛋白的表達，甚至誘導細胞凋亡。結論 siRNA特異性下調Grp78蛋白，可以抑制肺癌細胞A549的侵襲和轉移，甚至導致細胞凋亡。

【關鍵詞】 RNA干擾； Grp78； 肺癌細胞

Roles of RNAi of Grp78 on lung cancer cell A549 SONG Xiao-ping，LI De-hua，XI Huan-jiu.Department of Anatomy，Liao Ning Medical University，Jin Zhou 121001，China

【Abstract】 Objective To investigate the roles of RNAi of Grp78 on lung cancer cell A549.Methods To observe changes of invasions and metastasis of lung cancer cell A549 induced by transfection and expression of siRNA of Grp78.Results RNAi could interfere expressing of Grp78 of lung cancer cell A549， which depressed adhesion and migration of lung cancer cells， and expressing of MMP-2 and MMP-9 proteins significantly，even induce cell apoptosis.Conclusion The specifically downregulation of Grp78 protein induced by siRNA transfection， which could depress invasion and metastasis of lung cancer cell A549，even induced cell apoptosis.

【Key words】 RNAi; Grp78; Lung cancer cells

肺細胞癌是一種惡性程度極高的腫瘤，肺癌患者術后復發率高，極易轉移，預后差，因此，探尋有效的抑制肺癌侵襲和轉移的方法及其機制極為重要。肺癌的侵襲和轉移是一個十分復雜的過程，其中腫瘤細胞侵襲血管壁/淋巴管壁是最關鍵的步驟之一，抑制腫瘤細胞的血管壁/淋巴管壁的侵襲，可以有效抑制腫瘤的侵襲和轉移過程。研究表明，上皮-間葉轉化(epithelial-mesenchyuial-transition，EMT)是大多數上皮型腫瘤（包括肺癌）發生侵襲和轉移的基礎，上皮型腫瘤細胞必須首先發生上皮一間葉轉化，獲得間葉細胞的表型后才能發生侵襲和轉移。目前已經發現了許多參與腫瘤的侵襲和轉移過程調控的信號分子如小GTPase(包括Rac，RhoA和Cdc42)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、整聯蛋白連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF)等。人們一直嘗試通過干預這些信號分子的表達和活性達到抑制腫瘤的侵襲和轉移的目的，但沒有取得預期的效果，這可能是由于靶蛋白的功能比較單一，與其他的信號通路缺乏必要的通訊。

葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，Grp78)是由細胞的內質網合成、分泌的一種蛋白質，屬于Hsp70家族［1］。過去學者們一直認為Grp78是一種定位于內質網腔中的蛋白質，起分子伴侶的作用。近年來隨著研究的不斷深入，人們發現Grp78除了駐留在內質網腔中起到分子伴侶的作用外，還可以轉運至細胞膜，甚至分泌到細胞外，參與細胞分化、細胞生存、血栓形成等重要生物學過程的調控，是一種多功能蛋白質。在腫瘤細胞中，Grp78也參與腫瘤的發生與進展［2~4］，以及腫瘤的耐藥性調節［5］，但Grp78對腫瘤的侵襲和轉移調節機制國內外報道較少。

應用siRNA技術特異性下調肺癌細胞A549中Grp78的表達，觀察對細胞黏附、細胞伸展的影響，以及對能夠反應細胞侵襲和遷移能力的指標：細胞外基質重構相關蛋白基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2， MMP-2）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9， MMP-9）的表達及活性進行研究［6~8］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞來源及培養 人肺癌細胞A549（由中國醫科大學發育生物學教研室惠贈），加入DMEM培養液中（含10% 胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml的鏈霉素），置于CO2孵箱（95% CO2，5%O2）內，37 ℃培養，每3 d更換一次培養液。

1.2 主要實驗試劑 anti-Grp78、MMP-2、MMP-9、c-jun及p-c-jun（購于Santa Cruz公司）。明膠、纖粘連蛋白、蛋白酶抑制物混合物、BCIP/NBT（購于Sigma公司）。FITC標記的二抗（購于北京中杉公司）。Grp78特異性siRNA分子由TaKaRa公司合成，5-CGAUCAGGGCAACCGCAUC-3。

1.3 主要實驗設備 超凈工作臺(蘇州凈化，S W-LJ-2FD型)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS， CKX41型)；CO2孵箱(德國SIM， CELL 24D型)；熒光顯微鏡(美國Beckman-Coulter，Coulter Epics XL型)。

1.4 實驗方法

1.4.1 Grp78的RNA干擾 培養的人肺癌細胞A549，棄去培養液，加入0.25%胰蛋白酶消化1~2 min，終止消化，離心后重新懸浮，按1×106/ml密度接種于6孔培養板中，培養24 h。瞬時轉染按Qiagen公司的TransMessengerTM的操作說明進行，2 μg siRNA與4 μl轉染試劑混合，用稀釋液稀釋至100 μl，室溫下作用30 min，加入600 μl無血清、無抗生素培養液混勻。將細胞用PBS漂洗，加入siRNA-轉染試劑混合液，37 ℃，孵育4 h，4 h后棄去siRNA-轉染試劑混合液，加入完全培養液繼續培養。為了提高轉染的效率，按Kumiko Ui-Tei的方法采用3次轉染，每次轉染時間間隔為24 h。最后一次轉染后，加入完全培養液繼續培養72 h。

1.4.2 細胞黏附實驗 RNA干擾后的細胞，加入0.25%胰蛋白酶，消化2 min，無血清培養液稀釋至2×105/ml，接種于纖粘連蛋白（10 μg/ml）包被、1% BSA封閉的96孔板中，每孔接種100 μl，繼續培養1 h，PBS漂洗，4%甲醛固定20 min，1% 結晶紫染色20 min，0.4% Tween 20溶解過夜，于酶標儀上測定595 nm的OD值。

1.4.3 免疫熒光檢測 RNA干擾后的細胞，加入0.25%胰蛋白酶，消化2 min，以1×105/ml的密度接種于10 μg/ml L-多聚賴氨酸預包被的蓋玻片上，繼續培養24 h，待細胞充分伸展后取出蓋玻片，PBS漂洗，3.7% 甲醛固定30 min，0.2% Triton-X-100透化5 min，1% BSA封閉30 min，一抗（anti-Grp78）室溫溫育1 h，PBS漂洗，加入二抗（FITC標記的羊抗兔IgG），室溫避光，37 ℃孵育1 h，95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細胞的Grp78蛋白表達并隨機選取10個視野進行計數，記錄每個視野細胞的陽性表達率。

1.4.4 免疫印跡實驗 RNA干擾的方法如前所述，最后一次轉染后繼續培養72 h，將細胞樣品用TBS漂洗后加入RIPA緩沖液（1% NP-40、0.5% 脫氧膽酸鈉、1% SDS、0.1% PMSF）裂解細胞，考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。加熱變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶1000倍稀釋的一抗(Grp78， MMP-2， MMP-9)雜交2 h，TBST洗膜后加入二抗溫育1 h，TBST洗膜后進行BCIP/NBT顯色，采用Chemi-genius凝膠成像系統分析Grp78，MMP-2，MMP-9蛋白的表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件對數據進行單因素方差分析和卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA干擾對A549細胞的Grp78蛋白的影響 siRNA轉染肺癌細胞A549并進行表達，隨著轉染后時間的延長，Grp78蛋白表達呈時間依賴性減少（見圖1A，1B）。免疫印跡（Western-blot）實驗結果（見圖1C）顯示，Grp78蛋白量隨著siRNA干擾后逐漸減少。

2.2 SiRNA干擾Grp78蛋白對細胞黏附的影響 為了研究通過siRNA干擾特異性地下調Grp78蛋白對肺癌細胞A549黏附特性的影響，筆者應用細胞黏附實驗對細胞與細胞外基質的黏附能力進行了研究。結果顯示，Grp78-siRNA轉染細胞A595的OD值(A595=0.66)遠遠高于對照組（A595=0.35），統計學分析表明二者之間具有顯著性差異（P<0.05），這表明特異性下調Grp78可以促進細胞與細胞外基質的黏附（見圖2）。



A、Grp78蛋白免疫熒光染色（a、空白對照組;b、siRNA轉染24 h;c、siRNA轉染48 h;d、siRNA轉染72 h)

B、Grp78蛋白免疫熒光染色相對陽性率（與空白對照組相比較）

C、Western-blot檢測Grp78在A549細胞中的表達

2.3 siRNA 干擾Grp78蛋白對基質金屬蛋白酶（MMP-2， MMP-9）的作用 筆者應用免疫熒光染色和免疫印跡技術，對Grp78-siRNA轉染細胞中MMP-2、MMP-9 的活性分別明顯低于對照組（P<0.01）（見表1，圖3）；免疫印跡實驗結果顯示，Grp78-siRNA轉染細胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表達量明顯低于對照組（見圖4）。此外，c-jun的表達及磷酸化對MMP-2、MMP-9的表達及分泌過程中具有重要的調節作用。免疫印跡實驗結果顯示（見圖5），轉染siRNA干擾Grp78的A549細胞的磷酸化c-jun(p-c-jun)的表達水平明顯下降，而c-jun的表達沒有差異。

2.4 siRNA 干擾Grp78蛋白對A549細胞凋亡的影響 在轉染siRNA干擾A549細胞內Grp78蛋白，從而促進細胞的凋亡（圖6）。轉染后，細胞出現了典型的細胞凋亡形態學改變，可見細胞核由于濃集而呈亮紅色，核呈分葉狀或碎片狀，而各對照組則為正常細胞形態。

（a、空白對照組；b、載體對照組；c、siRNA組。白色箭頭顯示凋亡細胞）

3 討論

內質網分子伴侶糖調節蛋白家族（GRPs）是細胞微環境的重要成分，它們也與腫瘤的發生、發展密切相關。目前研究較多的是分子量為78 kD的Grp78，它定位于細胞膜、細胞質和內質網，甚至分泌到細胞外，是一種多功能蛋白質，參與許多重要的細胞活動，如細胞分化、細胞生存、血管形成、腫瘤的發生、抗腫瘤免疫等。

RNA干擾（RNA interference， RNAi）是最近幾年發現和發展起來的新興的基因阻斷技術，與以往的基因阻斷技術比較，RNAi更具有快速、有效、容易操作和序列特異性強等優點［9~11］。

本研究應用siRNA特異性下調肺癌細胞A549中的Grp78蛋白的表達，并觀察對肺癌細胞A549的生長、侵襲、轉移的影響，結果發現特異性地下調Grp78蛋白可以增強肺癌細胞A549的黏附能力，同時抑制與腫瘤細胞侵襲和轉移密切相關的MMP-2、MMP-9蛋白的表達，這可能提示，特異性下調Grp78蛋白的表達可以通過抑制MMP-2、MMP9的表達及活性而延緩甚至阻滯腫瘤細胞的侵襲和轉移。此外，研究表明c-jun的表達及磷酸化對MMP-2、MMP-9具有重要的調節作用，而特異性地下調Grp78蛋白可以抑制c-jun的磷酸化，從而進一步抑制MMP-2、MMP-9的表達及活性。研究中還發現，轉染siRNA特異性下調Grp78蛋白，還可以引起肺癌細胞A549的細胞凋亡，但其凋亡信號轉導途徑及其機制還有待進一步的研究闡述。

綜上所述，本研究結果表明，Grp78蛋白對于肺癌細胞A549的侵襲和轉移具有調節作用，通過特異性siRNA靶向下調Grp78蛋白的表達可抑制肺癌細胞A549的生長、侵襲和轉移，甚至可以引發細胞的凋亡，這為抑制肺癌侵襲和轉移提供了一個有效的作用靶點和方法。由于RNAi特異性強，作用迅速，操作簡單，也為治療和防治癌癥開辟了一個全新的領域。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-08-08）

（本文編輯：梅宏偉）