Twist與RECK在非小細胞肺癌中的表達及其對預后的影響

作者單位：261042 濰坊醫學院（馮凱，呂賓）；山東省濰坊市人民醫院（胡德宏，張居民，張振江）

通訊作者：馮凱

【摘要】 目的 通過免疫組化法實驗觀察Twist和RECK在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達，探討其在NSCLC中的臨床意義及對疾病預后的影響。方法 采用S-P免疫組化法檢測60例有完整資料的NSCLC術后腫瘤標本和60例距離腫瘤5 cm以上的正常肺組織中Twist與RECK蛋白的表達情況。通過Kaplan-Meier生存曲線法比較陽性組和陰性組患者的預后情況。結果 在非小細胞肺癌中Twist陽性表達率為65%，顯著高于癌旁組織中的8.3%；RECK陽性表達率為51.7%，低于癌旁組織中的85%。Twist在非小細胞肺癌組織中的陽性表達與腫瘤的TNM分期、原發腫瘤大小、淋巴結轉移情況及2年無瘤生存率有顯著的相關性（P＜0.05）。RECK在非小細胞肺癌組織中的表達與腫瘤TNM分期、原發腫瘤大小、淋巴結轉移情況及2年無瘤生存率存在相關性（P＜0.05），而兩者與其他病理因素無關（P＞0.05）。Twist與RECK在非小細胞肺癌組織中的表達具有相關性（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示患者術后2年無瘤生存率隨Twist陽性表達呈現下降趨勢，而隨RECK陽性表達顯著上升。結論 Twist、RECK可能在NSCLC的浸潤、轉移中存在相互作用，可作為反映NSCLC進展的重要生物學指標。Twist高表達、RECK低表達的患者易發生淋巴結轉移，預后較差，術后2年無瘤生存率較低。

【關鍵詞】 Twist； RECK； NSCLC； 預后； 免疫組織化學

Expressions of twist and rECK in non-small cell lung cancer tissues and their effects on prognosis FENG Kai，HU De-hong，ZHANG Ju-min，ZHANG Zhen-jiang，LV Bin. Weifang medical college， Weifang 261042，China

【Abstract】 Objective To observe the expressions of Twist and RECK in non-small cell lung cancer （NSCLC） and discuss their clinical significance and effects on disease prognosis through the immunohistochemical method experiment.Methods With the S-P Immunohistochemical method，the Twist and RECK protein expressions were detected in both 60 cases of NSCLC postoperative tumor specimens with complete information and another 60 cases of normal lung tissue with a distance of at least 5 cm from the tumor. It also made a comparison of the prognosis between the positive and negative patient groups through the Kaplan-Meier survival curve method.Results It showed that the positive expression rate of Twist in NSCLC （65%） was significantly higher than that in paracancerous normal tissues （8.3%），while the positive expression rate of RECK in NSCLC （51.7%） was lower than those in paracancerous normal tissues （85%）.The former had remarkable relation to the tumor differentiation， the depth of invasion， lymph node metastasis， the TNM stage and the 2 years'disease-free survival（P<0.05）， and the latter to the depth of invasion， lymph node metastasis， TNM stage and the 2 years'disease-free survival（P<0.05）. However， neither of them was related to any other pathological factors（P>0.05）. Besides，the expression of Twist in NSCLC and that of RECK was obviously related（P<0.05）.The analysis of Kaplan-Meier survival curve presented the declining tendency of disease-free survival rate of patients two years after treatment along with Twist expression and its increasing tendency along with RECK expression.Conclusion The expressions of Twist and RECK may play a cooperative role in the infiltration and metastasis of NSCLC， which may also serve as important biological parameters for judging the NSCLC progression. Patients with up-regulated expression of Twist and down-regulated expression of RECK were prone to have lymph node metastasis， poor prognosis and lower disease-free survival rate 2 years after operation.

【Key words】 Twist; RECK; NSCLC; Prognosis; Immunohistochemical

肺癌是人體最常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌是肺癌最常見的組織類型，腫瘤細胞的轉移和侵襲是影響肺癌預后的重要因素，它是一個多步驟、多階段發生及多基因參與調控的過程，也是臨床上肺癌治療效果不佳的關鍵因素^［1］。Twist能通過對細胞凋亡的抑制，參與腫瘤細胞周期調控，并通過調節腫瘤細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進腫瘤侵襲轉移，表現出癌基因的特點。RECK（reversion-inducing cysteine-rich protein KaZal motif）基因是日本學者Takahashi等發現的一種新的腫瘤抑制基因。其功能獨特性表現在抑制基質金屬蛋白酶表達與活性，同時RECK也具有較好抑制血管生成和成熟功能^［2］。關于NSCLC中Twist與RECK聯合表達與腫瘤轉移之間的關系，國內外鮮有此類報道。筆者通過免疫組化S-P法檢測兩者在非小細胞肺癌及正常肺組織中表達的差異及相關性，進一步探討兩者在NSCLC的侵襲、轉移中的作用和機制，以期尋找NSCLC早期診斷和判斷預后的分子指標，為肺癌的預后判斷提供客觀的依據，并可能為今后NSCLC的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2008年1月～2009年6月濰坊市人民醫院胸外科住院治療的NSCLC患者腫瘤標本60例作為實驗組，另取60例距離腫瘤5 cm以上的正常肺組織作為對照組。其中男45例，女15例，年齡30～76歲，中位年齡56歲，術前均未接受放化療。按照WHO肺癌分型標準及UICC（2009年）新的國際肺癌分期標準進行分型、分期，其中腺癌24例，鱗癌36例；Ⅰ期6例，Ⅱ期34例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。所應用試驗標本采用10%的福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.2 病例隨訪 以電話、信件等形式對60例肺癌手術患者進行隨訪，隨訪資料完整，無瘤生存期的計算從手術日期到隨訪截止日期（2011年6月），或出現腫瘤復發、轉移、死亡的日期為止。到隨訪截止日有2例失訪，有40例存活（其中4例出現復發），18例死亡（其中16例因腫瘤復發死亡，2例因意外死亡）。

1.3 免疫組化方法檢測Twist及RECK的表達，采用SP法，Twist和RECK兔抗人單克隆抗體均購自北京博奧森公司，Twist單克隆抗體（1∶150稀釋），RECK單克隆抗體（1∶100稀釋），染色步驟按說明書進行。

1.4 結果判定 RECK、Twist的陽性染色模式均為細胞漿著色，呈淺黃色至棕黃色顆粒。選具有代表性的10個高倍視野進行觀察計數，每個視野計數100個腫瘤細胞。在腫瘤細胞膜和（或）細胞質有黃棕色或玫瑰紅色顆粒沉著為RECK及Twist陽性染色。根據染色程度和染色細胞百分率進行評分，基本不著色為0分，著色淡為1分，著色適中為2分，著色深為3分；著色細胞占計數細胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片平均著色程度得分與平均著色細胞百分率得分各自相乘為其最后得分：1分為陰性（-），2～3分為（+），4～6分為（++），＞6分為（+++）。弱陽性表達指（+），強陽性表達指≥（++）。

1.5 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率表示，不同組間比較行χ²檢驗，生存率的組間比較采用Kaplan-Meier生存曲線法及Log-rank檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Twist和RECK蛋白表達的免疫組織化學檢測結果 Twist和RECK在癌旁正常肺組織中陽性表達分別為8.3%（5/60）和85%（51/60）；在NSCLC組織中兩者的陽性表達率分別為65%（39/60）和51.7%（31/60），陽性著色部位均為細胞質，少數伴有細胞膜染色，經比較，Twist及RECK蛋白在NSCLC組織和癌旁正常肺組織中的表達差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1、表2和圖1、圖2。

表1 Twist在非小細胞肺癌及癌旁正常組織中的表達

表2 RECK在非小細胞肺癌及癌旁正常組織中的表達

2.2 Twist、RECK在NSCLC組織中表達與臨床病理特征的關系 NSCLC組織中Twist、RECK表達均與臨床分期、原發腫瘤大小、淋巴結轉移情況及2年無瘤生存率密切有關（P＜0.05）；但與組織學分型、性別和分化程度無關（P＞0.05），見表3。

2.3 Twist、RECK在NSCLC組織中表達與淋巴結轉移情況之間的關系 將Twist與RECK表達狀況分為亞組，觀察其與淋巴結轉移的關系，發現Twist蛋白表達陽性及RECK陰性表達的NSCLC患者18例（30%），有淋巴結轉移者占77.78%（14/18）。該組患者淋巴結轉移率明顯高于其他亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表3 非小細胞肺癌Twist和RECK的表達與病理參數的關系

表4 NSCLC組織中Twist、RECK表達與淋巴結轉移

情況之間的關系

2.4 Twist、RECK在NSCLC組織中表達與患者術后2無瘤生存期的關系 本組患者有2例失訪，2例術后出現意外死亡，進行Kaplan-Meier生存曲線分析，結果顯示2年無瘤生存率Twist表達（-）組為80.0%，Twist表達（+）組為59.0%，全組中位無瘤生存期未達及，原因考慮為樣本量較小及隨訪時間較短造成。結果表明，患者術后生存期跟Twist的表達情況有相關趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。RECK表達（-）組患者2年無瘤生存率50.2%，中位無瘤生存時間為25.0月；RECK表達（+）組為82.6%，中位無瘤生存時間為39.0月，提示患者術后生存期隨RECK的陽性表達顯著上升，Log-rank檢驗結果顯示差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3、圖4。

2.5 Twist與RECK在NSCLC中表達的相關性 運用Spearman等級相關檢驗發現，60例非小細胞肺癌組織中Twist與RECK的表達成負相關（r-0.652，P＜0.05），見表5。

表5 Twist與RECK在NSCLC中表達的相關性

3 討論

Twist蛋白屬于堿性的螺旋-環-螺旋蛋白家族中的高度保守的轉錄因子，正常情況下主要表達于胎盤、胚胎中胚層和成人的某些中胚層來源的未分化組織，上皮-間葉變過程中一個重要的調節因子，上皮-間葉變（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤發生、發展的重要環節，腫瘤細胞出現EMT被認為是腫瘤轉移開始的標志^［3］，E-boxes啟動子的表達被Twist轉錄因子在轉錄水平上抑制，誘導EMT的形成，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達被抑制，使E-cadherin介導的細胞-細胞黏附功能喪失或消弱，惡性腫瘤細胞因此便容易從原發灶脫離向周圍其他組織侵襲，為惡性腫瘤的轉移提供必要條件^［4］。Twist已經被證明作用于多種惡性腫瘤細胞的發生及浸潤轉移過程中，Horikawa等^［5］研究發現在轉移性鼻咽癌中，Twist介導上皮間質化進而促進腫瘤的轉移。Zhang等^［6］發現Twist高表達在膀胱癌的進展中起重要作用，并與膀胱癌的分期具有相關性。Yang等^［7］對小鼠乳腺癌細胞株體內和體外的系列實驗研究表明，Twist在惡性腫瘤轉移階段表達明顯增強，應用RNA干擾技術后腫瘤細胞的存活時間和生長速率都顯著下降。本研究通過免疫組化法定性檢測分析NSCLC及癌旁組織中Twist的表達，證實Twist在NSCLC中陽性率為65%，對照組陽性率為8.3%，差異有統計學有意義（P＜0.05），結果說明Twist在NSCLC的發生、發展過程中可能發揮一定的作用。結果同時也證實Twist的表達與淋巴結轉移、分化程度、臨床分期、2年無瘤生存率密切相關（P＜0.05），因此，Twist在NSCLC組織中陽性表達水平的高低提示患者的預后。

1998年Takallashi等成功地從大鼠纖維母細胞株NIH3T3中克隆出轉移抑制基因，命名為RECK。RECK基因定位于人染色體9p12-13，整個基因的長度約87 kb，含有21個外顯子和20個內含子，是一種新發現的MMPs抑制劑。它能在轉錄后水平抑制至少3種MMPs，即MMP-2、MMP-9及MTI-MMP。MMPs通過降解血管周圍細胞外基質，調節和釋放血管活性因子，從而促進腫瘤新生血管形成。有研究發現，表達RECK的腫瘤組織血管新生受抑，微血管密度明顯下降，血管腔變粗大，盡管大血管周圍的部分腫瘤細胞能夠生存，但血管外周的大部分腫瘤細胞缺血壞死^［8］。這樣可以認為，RECK基因通過抑制MMPs酶活性與腫瘤血管生成兩方面抑制腫瘤侵襲和轉移。RECK作為一個獨立因素，與肝癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌等的預后密切相關，腫瘤組織中RECK表達陽性的患者預后均好于表達陰性的患者^［9～11］。本實驗結果表明：RECK蛋白在NSCLC組織中的陽性率為51.7%，在正常肺組織中的陽性率為85%，差異有統計學意義（P＜0.05），本研究證實隨著病變向晚期進展，RECK表達水平逐漸下降，出現淋巴結轉移者逐漸增多，2年無瘤生存率逐漸下降（P＜0.05）。因此，可以通過對RECK表達水平的檢測來預測患者預后。

Twist與RECK的表達可能在非小細胞肺癌的發生、發展和浸潤轉移過程中起重要作用，通過統計學數據分析表明，兩者成負相關關系，但兩者之間的具體相互作用機制還需進一步探討。如能進一步通過實驗證實在NSCLC患者外周血中能夠檢測到這兩種因子，并完善相關的檢測手段，有可能成為臨床上非小細胞肺癌患者早期診斷及預測預后的一種分子標記物。另外，研制能夠上調癌細胞中的RECK表達或者下調Twist表達的藥物，或通過基因治療使RECK低表達或者不表達的癌細胞中的RECK正常表達，對阻止腫瘤浸潤轉移具有重要的意義，從而為非小細胞肺癌的治療開辟新的途徑。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-07-27）

（本文編輯：陳丹云）