eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子基因多態性與腦梗死關系的研究

基金項目：韶關市科技局立項項目（韶科衛2010-35）

作者單位：512000 廣東省韶關市第一人民醫院（羅寧，李文銳，鄧彥，譚誠，張玉群）；廣東省韶關市粵北人民醫院（嚴文娜）

通訊作者：羅寧

【摘要】 目的 探討內皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）第7外顯子894G→T及第四內含子基因多態性在中國粵北地區漢族人群中的分布規律，并研究兩組基因多態性與腦梗死（Cerebral infarction，CI）的關系及兩種基因的連鎖關系。方法 本研究采用病例-對照研究，選擇中國粵北地區漢族人群130例健康體檢者（對照組）和148例經CT或MRI證實的腦梗死患者（CI組）為研究對象，用聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性分析方法（PCR-RFLP）和核苷酸序列測定技術相結合的分子流行病學研究方法，對內皮型一氧化氮合酶第7外顯子894G→T及第四內含子基因多態性進行檢測及分析。結果 腦梗死組eNOS基因外顯子7處第894位T等位基因頻率為10.5%，對照組為5.8%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05），T等位基因純合子攜帶者發生腦梗死的風險是GT或者GG純合子攜帶者的1.757倍（χ²3.89，P0.049，OR1.757，95% CI0.990～3.117）。第四內含子基因腦梗死組a等位基因頻率為12.5%，對照組為6.6%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05），4a基因純合子攜帶者發生腦梗死的風險是4b4a或者4b純合子攜帶者的1.8倍（χ²＝4.97，P0.026，OR1.860，95% CI1.099～3.149）。結論 研究顯示，eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子與腦梗死的發病有關，而且兩個基因位點之間并沒有連鎖不平衡的關系，提示eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子可能單獨作用或和其他位點協同作用對腦梗死的發病產生影響，是腦梗死遺傳危險因素。

【關鍵詞】 內皮型一氧化氮合酶； 腦梗死； 基因多態性

The association of endothelial nitricoxide synthase G894T in exon 7 and the 27-bp repeat in intron 4 genepolymorphisms with cerebral infarction LUO Ning，LI Wen-rui，YAN Wen-na，DENG Yan，TAN Cheng，ZHANG Yu-qun.The First People's Hospital of Shaoguan，Shaoguan 512000，China

【Abstract】 Objective To analyzsse the distribution characters of endothelial nitricoxide synthase G894T in exon 7 and the 27-bp repeat in intron 4 gene polymorphisms. And to research linkage genotype and the relationship between two gene polymorphisms and cerebral infarction in Chinese west of Guangdong Hans.Methods A case-control study of 148 cases confirmed by CT or MRI and 130 health individual controls from Chinese west of Guangdong Hans was carried out.The endothelial nitricoxide synthase G894T in exon 7 and the 27-bp repeat in intron 4 genotypes and gene frequencies were analyzed by molecular epidemiological study and the polymerase chain reaction （PCR） and restriction fragment length polymorphism（RFLP）. The relationship between two gene polymorphisms and cerebral infarction were investigated. Statistical analysis was carried out by SPSS 13.0 software.Results The frequencies of eNOS gene G894T T allele in CI cases and health control were 10.5% and 5.8%，T allele carriers had a 1.757-fold increased risk for cerebral infarction events（χ²＝3.89，P0.049，OR1.757，95% CI0.990-3.117）over Gggenotype carriers. The frequencies of 4a/4b in intron 4 of the eNOS gene 4a allele in CI cases and health control were 12.5% and 6.6%，T allele carriers had a 1.8-fold increased risk for cerebral infarction events（χ²＝4.97，P0.026，OR1.860，95% CI1.099-3.149）.Conclusion The study suggest that eNOS gene G894T T allele and the intron 4ab insertion/deletion genotype 4a/4b may be the genetic susceptibility of cerebral infarction.

【Key words】 Endothelial nitricoxide synthase; Cerebral infarction; Gene polymorphism

一氧化氮（nitric oxide，NO） 為內皮細胞舒血管因子，它作為重要的信使分子，參與心血管、神經、呼吸、免疫、內分泌、消化、生殖等多系統的生理與病理過程^［1］。較多的研究均表明NO參與了腦梗死的發生發展，而催化NO生物合成的酶稱為一氧化氮合酶（nitric ideynthase，NOS），根據原型酶的細胞和組織來源，分別稱為神經元型NOS （nNOS）、誘導型NOS （iNOS） 和內皮型NOS （eNOS） ^［2］。研究表明，不同亞型的NOS在腦缺血的損傷中作用不同，nNOS與iNOS產生的NO與神經損傷有關，eNOS產生的NO則有神經保護作用，因此和腦卒中關系更為密切^［3］。本研究探討兩組基因多態性與腦梗死（Cerebral infarction，CI）的關系及兩種基因的連鎖關系，為腦梗死提供理論和臨床防治的科學依據，具有重要的理論和現實意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 148例腦梗死患者均來自2009～2011年韶關市第一人民醫院神經內科住院患者，由神經科?？漆t生根據詳細的神經系統檢查，頭顱CT或MRI掃描以確診。另選擇130例與腦梗死患者年齡相當的健康體檢人員作為對照組，所選樣本均為血緣上的無關個體，且排除心腦血管（包括高血壓）、肝、腎、甲狀腺疾病及糖尿病患者。

1.2 方法 運用聚合酶鏈反應（PCR）技術擴增內皮型一氧化氮合酶第7外顯子894G→T及第四內含子基因目的片段，總反應體積為25 μl，混勻后，分別按以下程序于PE9600型DNA擴增儀擴增目的基因，Glu298Asp：95 ℃預變性5 min后，94 ℃ 30秒，52 ℃退火45秒，72 ℃延伸45秒，35個循環后再于72 ℃延伸5 min。第4內含子VNTR:94 ℃預變性5 min后，94 ℃ 1 min，56 ℃退火60秒，72 ℃延伸60秒，30個循環后再于72 ℃延伸5 min。Glu298Asp基因多態性：位點的擴增片斷長度為457bp，野生純合子（ GG 基因型） 用限制性內切酶Ban Ⅱ酶切PCR 產物后，因完全切斷形成320bp，137bp 兩條片段。突變雜合子（ TG基因型） 因含有G→T 點突變，PCR 產物部分被酶切斷，形成457bp、320bp、137bp 三條片段。突變純合子（ TT基因型） 則因完全不被切斷，僅為457bp 一條片段。第4內含子VNTR基因多態性：PCR 產物通過6%聚丙烯凝膠電脈分離，EB 染色，凝膠成像儀顯影，可見三種類型產物：（1）單一393bp 基因片段（4 個重復序列），即aa純合子；（2）單一420bp 基因片段（5 個重復序列），即bb 純合子；（3）393bp 和420bp 片段各一條，即ba 雜合子?；蛐蛄蟹治觯簩CR產物純化后，在基因測序儀上測序。血漿纖維蛋白原濃度測定：用比濁法測定。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件包和遺傳學數理統計方法進行統計分析，采用基因計數計算各組基因型頻率和等位基因頻率，OR（Odds Ratio）用Woolf修正公式，Hardy-Weinburg平衡吻合度，基因頻率統計分析及基因間的連鎖不平衡分析均采用χ²檢驗，確認各種因素對腦梗死的獨立危險因素。

2 結果

2.1 病例組及對照組的人口學特征及卒中危險因素對比 病例組及對照組的人口學特征及部分卒中危險因素的對比結果見表1，其中年齡、性別構成、吸煙在兩組間差異均無統計學意義（P>0.05），高血壓、膽固醇、甘油三酯兩組間差異有統計學意義（P<0.01）。

表1 病例組及對照組的人口學特征及部分卒中

危險因素對比

注：與對照組比較，^*P<0.01

2.2 eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子基因多態性分布及等位基因頻率 腦梗死組與對照組eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子基因頻率分布分別見表2、表3、表4、表5。eNOS外顯子7處第894位G被T替代的多態性有TT、GT、GG 3個基因型。腦梗死組eNOS T等位基因頻率為10.5，對照組為5.8，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。腦梗死組第7外顯子894G→T位T等位基因的攜帶者為20.3%，對照組為11.5%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

表2 eNOS第7外顯子894G→T多態性分布

注：與對照組比較，^*P<0.05

表3 eNOS第7外顯子894G→T等位基因頻率

注：與對照組比較，^*P<0.05

第四內含子基因位點CI組4a等位基因頻率為12.5%，對照組為6.6%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。CI組4a等位基因的攜帶者為24.3%，對照組為13.1%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

表4 eNOS第四內含子多態性分布

注：與對照組比較，^*P<0.05

表5 eNOS第四內含子等位基因頻率

注：與對照組比較，^*P<0.05

3 討論

腦梗死是危害人類健康的一類重要疾病，其發病的病理基礎是動脈粥樣硬化。研究表明，內皮源性一氧化氮合酶（Endothelial nitricoxide synthase，eNOS）基因多態性與動脈粥樣硬化密切相關^［4，5］。一氧化氮（NO）是目前公認的一種信息傳遞分子，在腦缺血損傷中具有神經保護和神經毒性雙重作用^{［6，7］}，這主要取決于NO產生的來源。NO可以阻止動脈粥樣硬化的關鍵步驟，而且NO分泌減少促進了動脈粥樣硬化的發展。事實上，NO除了強有力的血管舒張作用，還抑制血小板的黏附和聚集^［8］，影響黏附分子和趨化因子的表達^［9］，防止炎癥細胞浸潤^{［10，11］}，抑制平滑肌細胞遷移和增殖^{［12，13］}。由于NO性質活躍，不易準確測定，因而其合成酶——一氧化氮合酶（NOS）成為近年缺血性腦血管疾病研究的熱點。目前關于eNOS基因多態性與腦梗死的研究較少，并且多集中在單基因與腦梗死的關系。eNOS基因多態性與腦梗死的研究結果不盡相同。1998年Yahashi等^［14］對127例卒中日本患者該基因多態性與腦梗死的關系作了報道，認為在日本人中該基因多態性并不是缺血性腦血管病的遺傳危險因素。2001年Hou等^［15］對880 例中國人的研究顯示，eNOS 等位基因a 在缺血性卒中與對照組中的頻率比較差異有統計學意義（17%:7.8%，OR2.44，P<0.005），證實了eNOS 第4 號內含子基因多態性可能是中國人患腦梗死的獨立危險因素，特別在無常見危險因素的缺血性腦血管病患者中尤為顯著。國內狄群等^［16］對200例老年人該基因多態性與缺血性卒中的關系進行了研究，提示eNOS 基因Glu298Asp 多態性中Glu/ Asp 基因型與腦梗死相關。呂浩等^［17］作了同樣的研究，提示NOS基因的外顯子7處第894位G被T替代的突變與腦梗死的發生有關。

本研究用PCR-RFLP和核苷酸序列測定等技術，對148例腦梗死患者和130例健康人eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子基因多態性進行研究。初步分析了2個位點基因頻率在粵北地區漢族人群中的分布，研究結果發現，腦梗死組a等位基因頻率為12.5%，對照組則為6.6%，兩組比較差異具有統計學意義（P<0.05），表明在中國人群中第四內含子27 bpVNTR基因多態性與腦梗死的發病有關，等位基因a可能是腦梗死發病的危險因素。筆者對腦梗死患者和健康對照組進行研究，結果發現腦梗死組T等位基因頻率為10.5%，對照組則為5.8%，兩組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。兩個基因多態位點中，一氧化氮合酶第7外顯子894G→T基因位點及第四內含子基因多態均與CI相關，但兩者之間不存在連鎖不平衡關系（D-0.018，P>0.05），說明在中國粵北地區漢族人群中，第7外顯子894G→T基因位點及第四內含子27 bpVNTR可能單獨作用或和其他位點協同作用對CI的發病產生影響。

但腦梗死的發生與環境、遺傳等多方面因素相關，非單一因素所決定的疾病，所以eNOS第7外顯子894G→T及第四內含子與腦梗死的相關性研究，還有待進一步擴大研究對象的范圍，并建立更為嚴格的篩選標準，以避免分組、分層不同所造成的影響，加強多基因的連鎖相關性的研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-07-21）

（本文編輯：陳丹云）