膽囊癌中微淋巴管密度與HIF-1α表達的相關性

作者單位：519000 中山大學附屬第五醫院

通訊作者：呂寶軍

【摘要】 目的 研究分析微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density， MLVD）和缺氧誘導因子-1α （hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在膽囊癌組織中的表達情況及相關性。方法 用免疫組織化學方法檢測膽囊癌組織MLVD和HIF-1α的表達情況，分析兩者在膽囊癌組織中表達的相關性。結果 膽囊癌組織中MLVD和HIF-1α的表達明顯高于在慢性膽囊炎組織中的表達，差異均有統計學意義 （t4.033和χ²22.323，P<0.01）。膽囊癌組織中MLVD和HIF-1α的表達呈正相關（r＝0.573，P<0.05）。結論 膽囊癌組織中存在HIF-1α的高表達，HIF-1α與膽囊癌組織MLVD呈高度正相關。

【關鍵詞】 膽囊癌； 微淋巴管密度； 缺氧誘導因子-1α

Expression and correlation of MLVD and HIF-1α in gallbladder carcinoma XIE Xiao-ming，LV Bao-jun，GOU Xin-min，WANG Xiao-hong.The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Zhuhai 519000，China

【Abstract】 Objective To investigate the expression and correlation of MLVD and HIF-1α in gallbladder carcinoma.Methods MLVD and HIF-1α in 100 specimens of gallbladder carcinoma were detected by immunohistochemistry.The correlation of HIF-1α expression to MLVD was analyzed by Spearman's rank correlation.Results MLVD and HIF-1α were dramatically higher in the gallbladder carcinoma than that in the chronic cholecystitis tissues（t4.033 and χ²22.323，P<0.01）.The positive correlation was observed between MLVD and HIF-1α in the gallbladder carcinoma （r＝0.573，P<0.05）.Conclusion MLVD and HIF-1α expression of gallbladder carcinoma increase dramatically.HIF-1α was positively correlated MLVD in the gallbladder carcinoma.

【Key words】 Gallbladder carcinoma； Micro-lymphatic vessel density； Hypoxia inducible factor-1α

研究證實，D2-40是一種高度特異和高度靈敏的淋巴管標記物，它的發現促使腫瘤淋巴轉移的研究成為熱點^［1］。近年來大量文獻報道，HIF-1α是在乏氧環境下廣泛存在于人體內的一種信號轉錄因子，它在腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移和凋亡等方面起著十分重要的作用^［2］。本研究通過分析MLVD和HIF-1α表達的相關性，明確HIF-1α參與腫瘤淋巴結的轉移，從淋巴管生成的角度分析膽囊癌淋巴轉移機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取中山大學附屬第五醫院普通外科2007年1月～2010年1月收治的，經病理組織學確診且術后標本蠟塊保存完好的膽囊腺癌病理標本47例。隨機選取同期慢性膽囊炎標本25例做為對照組。膽囊癌患者年齡為36～72歲，中位年齡53.7歲；病理組織學分級：高分化腺癌15例，中分化腺癌20例，低分化腺癌12例。所有病例術前均未接受過新輔助化療及放射治療，并除外合并其他惡性腫瘤病例。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體D2-40、HIF-1α單克隆抗體、PV9000檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、生物素標記抗小鼠IgG等均購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 實驗方法 膽囊癌組織中D2-40標記的微淋巴管密度和HIF-1α表達的測定（免疫組化Envision法）。所有標本經40 g/L甲醛溶液固定，常規脫水包埋，Envision免疫組化二步法染色。D2-40用已知陽性切片做陽性對照，HIF-1α陽性照片由中杉金橋公司提供，以PBS代替第一抗體作陰性對照。

1.4 結果判斷標準 微淋巴管密度（MLVD）計數：D2-40蛋白定位于細胞質或細胞膜中，陽性表達為出現棕黃色或褐色顆粒。D2-40陽性標準以及MLVD計數參照Weidner^［3］方法并加以改進，任何被染成黃色或棕黃色孤立的內皮細胞，不以能否形成管腔為計數單位，而以聚集成條裂隙狀、索狀或管狀細胞團，并且能與附近的腫瘤細胞和（或）結締組織分開，作為一個微淋巴管計數。高倍鏡下選取4個視野內的微淋巴管數，測量窗面積為0.906 mm²，取其平均數作為該腫瘤的MLVD值，各組MLVD用均數±標準差表示。HIF-1α蛋白以細胞核內有棕黃色顆粒為陽性，僅少數胞漿著色的細胞記為陰性。首先，以陽性細胞百分率計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。再次以染色強度分為4個等級，無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，最后將兩者積分乘積為0表示陰性（-），＞1為陽性，其中1～2 表示弱陽性（+），3～4表示陽性（++），≥5為強陽性（+++）。

1.5 統計學處理 使用SPSS 12.0統計軟件進行數據分析。計數資料采用χ²檢驗，計量資料采用t檢驗；MLVD與HIF-1α表達的相關性采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膽囊癌組織中MLVD和HIF-1α的表達 D2-40陽性表達定位于淋巴管內皮細胞，D2-40陽性的脈管從形態上看符合淋巴管的特征：單層內皮細胞構成，管壁較薄，而陰性染色的脈管即血管，其內含有紅細胞。陽性染色的淋巴管在膽囊癌組織和慢性膽囊炎組織中均可見到，而在膽囊癌組織中，絕大多數淋巴管位于腫瘤間質組織內，形態不規則，管腔大小不一，管壁薄，癌細胞侵入部分淋巴管內。膽囊癌組織中MLVD和HIF-1α的表達明顯高于慢性膽囊炎組織的表達，差異均有統計學意義（t4.033和χ²22.323，P<0.01），見表1。

表1 膽囊癌和慢性膽囊炎組織中MLVD和

HIF-1α的表達

注：兩組MLVD比較，t4.033，P<0.01；兩組HIF-1α陽性例數比較，χ²22.323， P<0.01

2.2 膽囊癌組織中MLVD和HIF-1α表達的相關性分析 根據癌組織中HIF-1α表達的評分值與MLVD值的關系，作Spearman等級相關性分析，MLVD和HIF-1α之間密切相關（r＝0.573，P<0.05）。

3 討論

近年來大量文獻報道，HIF-1α是在乏氧環境下廣泛存在于人體內的一種信號轉錄因子，它在腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移和凋亡等方面起著十分重要的作用。HIF-1是由α和β兩個亞基組成的異源二聚體轉錄激活因子，其中HIF-1α為HIF-1受氧調節的特異亞單位。腫瘤組織中HIF-1α過度表達與上調VEGF、刺激血管生成和不良預后有關。目前的研究表明，HIF-1α過度表達在膀胱移行細胞癌和大腸癌細胞的浸潤、轉移和腫瘤血管的生成中起重要作用，HIF-1α有望成為預測腫瘤診斷、復發以及監測腫瘤浸潤、轉移的一個重要指標^［4］。

腫瘤的遠處轉移包括血道和淋巴道轉移，腫瘤的淋巴道轉移機制目前還不是很清楚。近年來，D2-40的發現得到了一種高度特異和敏感的淋巴管內皮細胞標記物，從而促使淋巴管生成和腫瘤轉移之間的關系成為目前研究的熱點之一。研究證實，D2-40分子量為40KD，是一種單克隆抗體，能夠特異性地結合唾液酸糖蛋白（M2A），而M2A僅僅存在于淋巴管內皮細胞，D2-40對淋巴管內皮細胞的標記具有很高的特異性和敏感性，D2-40可以廣泛應用于腫瘤組織淋巴管的研究^［5］。

最近，王亞秋等^［6］研究表明，甲狀腺乳頭狀癌中HIF-1α調節VEGF-C（vas- cular endothelial growth factor-C，血管內皮生長因子）的表達，共同參與了淋巴結轉移的過程。VEGF-C又稱淋巴管生成因子。近年來許多學者的同類實驗都說明了HIF-1α的表達與腫瘤淋巴道的轉移可能存在著一定的聯系。本實驗利用特異性淋巴管內皮細胞標記物D2-40，應用免疫組織化學方法進行膽囊癌組織MLVD的測定，以及膽囊癌中HIF-1α表達情況的研究，分析MLVD和HIF-1α表達的相關性，明確HIF-1α參與腫瘤淋巴結的轉移，從淋巴管生成的角度探討膽囊癌淋巴道轉移機制，完善和補充了腫瘤浸潤轉移的理論，為尋求抗腫瘤治療的可能途徑提供實驗依據和新思路。

本文通過免疫組化的方法，初步分析了膽囊癌組織MLVD和HIF-1α表達的相關性。結果表明，MLVD和HIF-1α在膽囊癌組織中高表達，MLVD和HIF-1α在膽囊癌組織中的表達具有正相關性。說明膽囊癌組織中HIF-1α促進了MLVD的高表達，提示HIF-1α參與了膽囊癌淋巴管的形成以及腫瘤細胞的淋巴轉移，其具體機制尚待進一步研究。

參 考 文 獻

［1］ 李錫清， 劉陶文.D2-40在腫瘤淋巴管轉移中研究進展. 華夏醫學， 2010， 23（2）:204-208.

［2］ 趙小祺， 王春光， 張靜.缺氧誘導因子-1研究進展. 河北北方學院學報:醫學版，2009，26（5）:73-75.

［3］ Weidner N， Folkman J， Pozza F，et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Natl Cancer Inst，1992， 84（24）:1875-1887.

［4］ Koh MY， Spivak-Kroizman TR， Powis G. HIF-1alpha and cancer therapy.Recent Results Cancer Res，2010，180:15-34.

［5］ Kahn HJ，Bailey D，Marks A.Monoclonal antibody D2-40，a new marker of lymphatic endothelium，reacts with Kaposi's sarcoma and a subset of angiosarcomas.Mod Pathol，2002， 15（4）:434-440.

［6］ 王亞秋，華清泉.甲狀腺乳頭狀癌中缺氧誘導因子-1α和血管內皮生長因子及血管內皮生長因子-C表達的臨床意義.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，21（5）:204-207.

（收稿日期：2011-08-23）

（本文編輯：陳丹云）