新痹痛靈對CIA大鼠關節炎癥及T細胞亞群的影響

劉晏 魏剛 陸兔林

[摘要] 目的 觀察新痹痛靈對CIA大鼠脾臟T細胞亞群、白介素-2（IL-2）及白介素-2受體（IL-2R）的影響，探討新痹痛靈治療類風濕關節炎的作用機制。 方法 44只SD大鼠建立膠原誘導的關節炎模型（CIA），造模成功的36只大鼠隨機分為4組： 模型組、陽性藥組、新痹痛靈中劑量組、新痹痛靈高劑量組，每組各9只，另取9只正常SD大鼠為正常組。造模成功后連續給藥28 d，末次給藥后取血，運用流式細胞儀檢測大鼠脾臟CD4+ T細胞及CD8+ T細胞的變化，ELISA檢測觀察大鼠脾臟IL-2、IL-2R。 結果 與模型組比較，新痹痛靈中劑量組、新痹痛靈高劑量組的CD4+/CD8+比值下調，IL-2與IL-2R水平下降，差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。形態學觀察顯示：新痹痛靈對滑膜細胞增殖有抑制作用。 結論 新痹痛靈對T細胞亞群及其相關炎癥因子的紊亂調節作用，可能是其治療類風濕關節炎的機制之一。

[關鍵詞] 新痹痛靈；CIA大鼠；T細胞亞群；IL-2；IL-2R

[中圖分類號] R593 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0008-04

Effects of New Bitongling Compound on the T cell semi-group of CIA rats

LIU Yan1 WEI Gang2 LU Tulin3 GUO Haiying1 WANG Yue1

1.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China； 2.Jiangsu Province Hospital of TCM， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China；3.Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210000， China

[Abstract] Objective To observe the effects of New Bitongling Compound on the T cell semi-group， IL-2 and IL-2R， and study the mechanism of New Bitongling Compound treating RA. Methods 44 SD rats were established collagen-induced arthritis （CIA） model， successful CIA 36 rats were randomly divided into 4 groups： model group， positive drug group， middle-dose New Bitongling Compound group， high-dose new Bitongling Compound group， with 9 rats in each group， 9 normal SD rats were as normal group. After model successfully established， the rats were given drugs for 28 d， blood sample was taken after the last administration. The CD4+ and CD8+ T cell in spleen of CIA rats were detected by flow cytometer， the IL-2 and IL-2R were detected by ELISA. Results Compared with model group， the CD4+/CD8+ ratio of middle-dose New Bitongling Compound group and high-dose New Bitongling Compound group decreased， the level of IL-2 and IL-2R also reduced， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）. Morphological observation indicated that New Bitongling Compound had significant in-hibitory on synovial cells proliferation. Conclusion New Bitongling Compound can regulate the abnormal T cell semi-group IL-2 and IL-2R， which may be one of its mechanism of treatment of rheumatoid arthritis.

[Key words] New Bitongling Compound； CIA rats； T cell semi-group； IL-2；IL-2R

類風濕關節炎（RA）是一種以對稱性多關節炎為主要表現的系統性、自身免疫性疾病，其基本病理改變是滑膜炎，病因研究至今尚無明確定論。研究表明，T細胞是RA關節滑膜中數量最多的一類炎癥細胞，且處于激活狀態，對RA病理的持續進展起重要作用[1]，而白介素2（IL-2）與白介素-2受體（IL-2R）是與T細胞密切相關的炎癥因子，是反映機體細胞免疫功能的重要指標[2，3]。

新痹痛靈是從全國名老中醫汪履秋教授治療中醫“痹證”（尤其是類風濕關節炎）的經驗方變化而來，由朱丹溪上中下通用痛風方化裁，在結合了前期的實驗及臨床研究后總結而出。為進一步研究新痹痛靈治療痹證的療效和機制，本實驗分別從T細胞亞群和炎癥因子兩個方面，對新痹痛靈進行了實驗研究[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 新痹痛靈浸膏制備 中藥飲片購于江蘇省中醫院門診部藥房，浸膏制作程序由南京中醫藥大學中藥炮制教研室研制，江蘇省中醫院制劑部加工而成。痹痛靈浸膏主要制備工藝：取桂枝等提取揮發油、麻黃等醇提、制川烏等水提，減壓回收乙醇至無醇味的浸膏。取一定量浸膏烘干稱其質量，計算浸膏得率為9.3%，即浸膏折合原藥材為每1克浸膏含生藥量10.75 g。

1.1.2 其他 雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司，生產批號1403111B；牛Ⅱ型膠原蛋白，美國Chondrex公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑，美國Sigma公司；Anti-CD3-APC單抗，美國eBioscience公司，E16085-103；Anti-CD4-FITC單抗，美國eBioscience公司，E00074-1632；Anti-CD8-PE單抗，美國eBioscience公司，E01045-1643；紅細胞裂解液，美國genscrip公司，C31141409；大鼠IL-2、IL-2R ELISA檢測試劑盒，R&D公司。流式細胞儀，型號：FACS Calibur，BD公司；臺式大容量高速離心機，型號：5810，Eppendortf公司；酶標儀，型號：EnVision，PerKin Elmer公司。

1.2 實驗動物

健康SD雄性大鼠（180±20g），4周齡，北京維通利華實驗動物技術有限公司；動物合格證號：SCXX（京）2012-0001。動物飼養在南京中醫藥大學SPF級動物房，實驗開始前一周進行適應性飼養1周，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及給藥 本實驗共54只大鼠，10只大鼠不做任何處理為正常組，44只大鼠在適應性喂養1周后進行膠原誘導的關節炎模型（CIA）造模，無菌條件下將牛Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ，CⅡ）溶于0.05 mol/L乙酸溶液（濃度為2 mg/mL），置4℃冷庫、避光搖蕩過夜充分溶解后，再與等量弗氏完全佐劑充分混合（Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL），于每只大鼠尾根部1～2 cm處按0.2 mL/只皮下注射；7 d后行加強免疫，取加強免疫乳膠混合物（將初次免疫中將完全佐劑換成不完全佐劑），按0.1 mL/只于尾根部1～2 cm處皮內注射，其余操作同初次免疫，造模共21 d。以AI值>2為造模成功，44只大鼠中36只CIA造模成功，造模成功率為81.8%。36只大鼠隨機分為4組，每組各9只大鼠，即模型組：給予等量蒸餾水；陽性藥組：雷公藤多苷片溶液0.012 g/kg；新痹痛靈中劑量治療組：給予3.95 g/kg；新痹痛靈高劑量治療組：給予15.8 g/kg；另取9只正常組大鼠給予等量蒸餾水；各組于造模成功后給藥，每日1次，連續28 d[5-7]。

1.3.2 大鼠的一般情況及AI的計算 體重（g）分組前及用藥前各1次、用藥后每周測1次；全身整體狀況觀察包括大鼠形體、毛色、反應、活動情況、食欲、大小便。于初次免疫前1 d，初次免疫后每周用肉眼觀察，依據關節腫大、變形、顏色及關節活動情況對大鼠足趾關節炎癥進行評分，肉眼觀察AI值>2分說明CIA大鼠造模成功。具體評分標準參考文獻[8]方法，無關節腫大為0分；有紅色斑點和輕度腫脹為1分；關節中度腫脹為2分；關節嚴重腫脹為3分；關節嚴重腫脹且不能負重為4分。

1.3.3 脾臟T細胞亞群及細胞因子的檢測 各組大鼠于末次給藥24 h后股動脈放血處死，取胸腺、脾臟，去除臟器表面游離組織、被膜，用生理鹽水沖干凈，用眼科剪將脾臟剪碎后，加入3 mL生理鹽水，用一個覆蓋300目尼龍網的燒杯過濾至錐形管內，即得脾臟單個細胞懸液。取1 mL的脾臟淋巴細胞懸液于離心管中，在室溫下以1500 r/min，離心4 min，取出后傾倒上清（勿破壞下面的沉淀）加入抗體，渦旋后，避光孵育15 min，脾臟組加入1 mL的紅細胞裂解液原液，避光孵育10 min。以1500 r/min，離心4 min，去上清，加PBS緩沖液500 μL，吹打后用渦旋機渦旋，再次在室溫下以1500 r/min，離心4 min，去上清，加500 μL的PBS緩沖液，使用流式細胞儀檢測。將另一部分脾臟放入液氮中凍存，按試劑盒說明書以ELISA法測定脾臟IL-2、IL-2R，依次稀釋標準品；加樣、孵育；加酶、孵育；加顯色劑；測定各個標本的吸光度（OD值）。

1.3.4 組織形態學觀察 心臟采血后脫頸處死后取右側踝關節剔除皮毛、肌肉、筋膜等，將保留完整的踝關節和滑膜組織固定于4%多聚甲醛固定液中1周[9]。關節病理制作及形態學檢測參考文獻[9]方法，依次脫鈣、固定標本、制作標本蠟塊、切片、然后進行HE染色、最后拍照保存進行病理評分。病理學評分參照文獻[10]方法，具體評分標準如下：關節組織病理學評分標準如下：0分：沒有組織病理學改變；1分：輕微局灶性浸潤；2分：中度浸潤；3分：嚴重炎癥浸潤，但無血管翳形成或軟骨損傷；4分：非常嚴重的浸潤形成血管翳和/或軟骨、骨侵蝕。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據資料的統計分析。正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況的評估及模型的鑒定

第2次免疫后1周左右，大鼠陸續發病，表現為足趾腫脹，至21 d左右，36只大鼠（81.8%）達到急性炎癥期表現：關節腫脹明顯。癥狀一般自后踝先發，逐漸加重，累及趾間關節、前足等，嚴重者四肢腫脹不能承重、活動受限。肉眼觀察大鼠AI值>2，造模成功。

2.2 新痹痛靈對T細胞亞群的影響

造模后模型組CD4+數值顯著升高（P < 0.05），致使CD4+/CD8+比值上升（P < 0.05）；予給藥干預后，CD4+、CD4+/CD8+均有不同程度回降（P < 0.05）；但CD8+數值并未見規律性改變，可見CD4+數值在最終結果中占決定性地位。見表1、圖1～2。

表1 新痹痛靈對T細胞亞群的影響（n = 9，x±s）

注：與模型組相比，*P < 0.05

圖1 正常組大鼠CD4+ T細胞流式圖

2.3 新痹痛靈對脾臟IL-2、IL-2R的影響

造模后大鼠脾臟IL-2與IL-2R均有顯著上升（P < 0.01），予給藥干預后，均有不同程度回落，其中陽性藥組藥效最為顯著，新痹痛靈高劑量組其次，新痹痛靈中劑量組最末。見表2。

表2 新痹痛靈對脾臟IL-2、IL-2R的影響（n = 9，x±s）

注：與模型組比較，*P < 0.01， **P < 0.05

2.4 病理形態學觀察

對比各組病理切片，正常組（圖3）關節及滑膜結構正常，關節軟骨表面光滑平整，無炎細胞及淋巴細胞浸潤現象，無血管翳形成。模型組（圖4）見明顯滑膜、軟骨壞死，陽性藥組（圖5）、新痹痛靈中劑量組（圖6）出現滑膜、軟骨破壞，炎性細胞浸潤，但較模型組有明顯改善。

正常組大鼠關節表面被覆透明軟骨，關節囊腔光滑，關節滑膜細胞連續平整、結構層次清晰，未見滑膜腫脹、組織壞死、炎細胞浸潤

圖3 正常組大鼠關節病理（HE染色，400×）

圖4 模型組大鼠關節病理（HE染色，400×）

圖5 陽性藥組大鼠關節病理（HE染色，400×）

圖6 新痹痛靈中劑量組大鼠關節病理（HE染色，400×）

3 討論

RA是一種以大量T細胞浸潤為主的慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其發病機制與T細胞亞群數量和功能有密切關系[11]。

本實驗結果顯示，T細胞流式實驗中，CIA模型大鼠脾臟CD4+T細胞明顯升高（P < 0.01），而CD8+T細胞無明顯增長或下降規律，但最終模型組CD4+/CD8+比值較空白組升高（P < 0.05），說明T細胞在類風濕關節炎的發病過程中其重要作用。而在陽性藥和新痹痛靈治療后，脾臟組織中CD4+ T細胞與CD4+/CD8+比值均有回降（P < 0.05）。同時，在IL-2及IL-2R實驗中，模型組IL-2的數值明顯升高（P < 0.01），予陽性藥（雷公藤多苷）及新痹痛靈治療后，脾臟中IL-2有不同程度的下降，陽性藥組和新痹痛靈對脾臟IL-2均由回調作用，但從實驗數值上可以看出，陽性藥組藥效最強（P < 0.01），對新痹痛靈有劑量依賴性。

既往研究表明，CD4是T輔助/誘導細胞的表面標志，CD4+ T細胞具有輔助T細胞轉變成效應細胞、B細胞轉化成漿細胞以及活化巨噬細胞等功能[12-14]。CD8是T抑制/殺傷細胞的表面標志，CD8+ T細胞具有細胞毒效應及抑制T細胞活化、抑制B細胞產生抗體，起抑制細胞及體液免疫的作用，因此，CD4+、CD8+數目的變化，尤其CD4+/CD8+比值是RA發病及免疫損傷的中心環節[15]。IL-2主要是由外周免疫器官（如脾臟、淋巴結等）的CD4+輔助細胞產生，同時也具有刺激T細胞增殖的能力，IL-2起的是受體間的相互作用。各種細胞表面有與IL-2結合的蛋白，稱為IL-2R[3，16]。而可被釋放和溶解的IL-2R，稱為可溶性白介素-2受體（sIL-2R），大劑量IL-2輸入體內能引起血清sIL-2R濃度的增高[17，2]。本實驗中，CIA大鼠脾臟CD4+升高，CD4+/CD8+比值、IL-2、sIL-2R均上升，提示Th細胞功能相對亢進和Ts細胞功能相對減弱。表明，新痹痛靈可能通過抑制Th細胞功能亢進，并增強Ts細胞功能，對類風濕關節炎起到治療作用。

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（收稿日期：2015-08-27 本文編輯：蘇 暢）