MTT法對(duì)大腸癌的藥敏實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用研究

[摘要] 目的 探討用MTT法測(cè)定大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物體外敏感性，研究大腸癌藥敏的異質(zhì)性和個(gè)體化療的可行性。方法 用MTT法檢測(cè)40份大腸癌標(biāo)本對(duì)氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑（L-OHP）、伊立替康（CPT）單藥應(yīng)用、兩藥及三藥（全量或半量）聯(lián)合應(yīng)用的敏感性。結(jié)果 不同標(biāo)本的藥物敏感性存在明顯差異，單藥中最有效的藥物依次為伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶，敏感率分別為35.0%、27.5%和20.0%；兩藥聯(lián)合應(yīng)用均優(yōu)于各自單藥的抑制效果（P＜0.05），伊立替康聯(lián)合奧沙利鉑弱于伊立替康或奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯(lián)合的抑制效果（P＜0.05）；三藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果顯著優(yōu)于兩藥聯(lián)合（P＜0.05），三藥全量及半量聯(lián)合應(yīng)用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 大腸癌對(duì)抗癌藥物的敏感程度普遍較低，且存在明顯異質(zhì)性。試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療經(jīng)驗(yàn)比較一致，MTT可用于為大腸癌患者選擇合適的化療藥物。由氟尿嘧啶、奧沙利鉑及伊立替康的聯(lián)合應(yīng)用具有高效協(xié)同抑制大腸癌細(xì)胞的作用，可為臨床難治性和復(fù)發(fā)性大腸癌患者的化療提供參考。

[關(guān)鍵詞] MTT法；大腸癌；藥物敏感性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）22-26-03

Clinical Application and Evaluation of Chemosensitivity of Human Colorectal Cancer Determined by MTT Assay in Vitro

YANG Leilei1 DAI Yuechu2 DONG Milian2 YE Pubo1 LIAO Wei1 MEI Tong1

1.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China；2.Affilicated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical College，Linhai 317000，China

[Abstract] Objective To investigate the heterogeneity of chemo sensitivity in colorectal cancer using an MTT assay and the feasibility of individual chemotherapy. Methods The growth-inhibition effects of irinotecan（CPT），oxaliplatin（L-OHP） and fluorouracil（5-FU），single drug，two or three drugs on 40 human colorectal carcinoma cells were observed by MTT assay. Results There were considerable differences in chemo sensitivity between individuals. The most active single drugs in the assay was identified as irinotecan（CPT），oxaliplatin（L-OHP）and fluorouracil（5-FU）；35.0%，27.5% and 20.0% of specimens showed sensitivity to them，The inhibitory rates of any two drugs were significantly higher than those in single drug group（P＜0.05）．The growth-inhibition effect of CPT combined with L-OHP was lower than that of CPT or L-OHP combined with 5-Fu（P＜0.05）. The growth-inhibition effect of the three drugs combination was significantly enhanced compared with regiment of two drugs combination chemotherapy（P＜0.05）． Furthermore，whole-dose and half-dose combination of 3 drugs reached similar cell growth inhibitory rate（P＞0.05）. Conclusion There was the heterogeneity of the in vitro chemosensitivity in colorectal cancer. The use of the MTT assay provides a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in colorectal cancer. The regiment of three drugs in the 5-FU+L-OHP+CPT can synergistically inhibit the proliferation of human colorectal carcinoma cells，which provided reference for the chemotherapy of refractory and recurrent colorectal carcinoma patients．

[Key words] MTT assay；Colorectal carcinoma；Chemosensitivity

化療是臨床治療惡性腫瘤的重要手段之一，大腸癌中、晚期患者術(shù)后需輔助化療。大腸癌普遍存在化療耐藥問(wèn)題，經(jīng)驗(yàn)化療因用藥缺乏客觀(guān)依據(jù)給患者帶來(lái)許多痛苦。為了提高用藥的針對(duì)性和敏感性，在化療前進(jìn)行體外抗腫瘤藥敏性測(cè)定顯得尤為重要[1，2]。利用癌細(xì)胞原代培養(yǎng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)可針對(duì)性地指導(dǎo)治療由于大腸癌對(duì)化療藥物敏感性存在的個(gè)體差異。因此，如何能為患者在化療前篩選出敏感藥物，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，是當(dāng)前腫瘤學(xué)界的主要研究方向。本研究用MTT法對(duì)40份新鮮大腸癌手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了體外藥敏檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集本院2010年3～6月大腸癌手術(shù)患者（男23例，女17例；年齡18～88歲，中位年齡53歲）標(biāo)本40份，經(jīng)病理證實(shí)均為原發(fā)腫瘤，且術(shù)前未經(jīng)放化療或免疫治療。其中結(jié)腸癌12份（腺癌9份，黏液腺癌2份，印戒細(xì)胞癌1份），直腸癌28份（腺癌25份，黏液腺癌2份，乳頭狀管狀腺癌1份）；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期24份，Ⅲ期14份，Ⅳ期2份。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道血漿峰值藥物濃度（PPC）和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定伊立替康、奧沙利鉑基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)濃度（BTC）分別為12.0g/mL、10.0g/mL。聯(lián)合用藥時(shí)采用伊立替康終濃度為12.0g/mL（全量）和6.0g/mL（半量）、奧沙利鉑為10.0g/mL（全量）和5.0g/mL（半量）。

1.2.2 試劑 培養(yǎng)液RPMI-1640（美國(guó)Sigma公司）、10％十二烷基硫酸鈉（SDS長(zhǎng)沙科泰科研試劑有限公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、四甲基氮唑藍(lán)MTT（美國(guó)Sigma公司）、膠原酶（美國(guó)Sigma公司）、胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)儀statFax2100（美國(guó)）。CO2培養(yǎng)箱（FORMA 3111美國(guó)）。

1.4 體外藥敏試驗(yàn)

無(wú)菌取新鮮大腸癌手術(shù)標(biāo)本，在含抗生素培養(yǎng)基中浸泡20min，剪成0.5～1.0mm3碎塊，置50mL離心管中，加10mL含混合消化酶的培養(yǎng)基，37℃消化1h。200目篩網(wǎng)過(guò)濾，獲單細(xì)胞懸液，用1640培養(yǎng)基洗2次。臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)活腫瘤細(xì)胞數(shù)。大腸癌細(xì)胞培養(yǎng)于含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，以0.25％胰酶消化后制成1×105/mL細(xì)胞懸液，于2個(gè)96孔板中每孔接種200μL，37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，于96孔板中加入藥物，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。96孔板分為空白組、對(duì)照組和藥物實(shí)驗(yàn)組。藥物實(shí)驗(yàn)組又分為：①單藥組，伊立替康全量、奧沙利鉑全量、氟脲嘧啶全量；②兩藥聯(lián)合化療組，伊立替康全量+奧沙利鉑全量、伊立替康全量+氟脲嘧啶、奧沙利鉑全量+氟脲嘧啶；③三藥聯(lián)合化療組，伊立替康全量+奧沙利鉑全量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奧沙利鉑半量+氟脲嘧啶、伊立替康全量+奧沙利鉑半量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奧沙利鉑全量+氟脲嘧啶。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。單藥組加入各自濃度藥物100μL；2種藥物聯(lián)合用藥時(shí)采用1︰1方案，使藥物濃縮1倍后各加50μL，使每孔的藥物濃度、體積和總量不變；3種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，采用1︰1︰1方案，使藥物濃縮2倍后各加25μL，再補(bǔ)加25μL培養(yǎng)基以使藥物濃度及總量不變。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱48h后，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150μL，充分溶解10min。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（測(cè)定波長(zhǎng)490nm、參比波長(zhǎng)630nm）測(cè)定各孔光密度值（OD值），空白組OD＜0.005、實(shí)驗(yàn)組OD＞0.1為有效實(shí)驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算平均抑制率（IR），IR＝[1－（用藥組平均OD值－空白組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值－空白組平均OD值）]×100％。IR標(biāo)準(zhǔn)采用1978年全國(guó)抗癌藥物會(huì)議制定的《腫瘤藥物通用指標(biāo)》IR＜30％為不敏感，歸陰性；30％＜IR＜50％為敏感；IR＞50％為中度敏感，歸陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用行乘列的卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同標(biāo)本的藥物敏感性存在明顯差異，單藥中最有效的藥物依次為伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶，敏感率分別為35.0%、27.5%和20.0%；兩藥聯(lián)合應(yīng)用均優(yōu)于各自單藥的抑制效果（P＜0.05），伊立替康聯(lián)合奧沙利鉑弱于伊立替康或奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯(lián)合的抑制效果（P＜0.05）；三藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果顯著優(yōu)于兩藥聯(lián)合（P＜0.05），三藥全量及半量聯(lián)合應(yīng)用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

MTT法是一種近年來(lái)研究較廣泛的方法，該方法由Mosman于1983年首創(chuàng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用MTT法在腫瘤體外藥敏試驗(yàn)方面積累了一定的臨床和實(shí)驗(yàn)資料，認(rèn)為該法是簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)的藥敏方法，臨床相關(guān)性較高[3-5]。不僅對(duì)臨床個(gè)體化療有重要指導(dǎo)意義，而且在研究抗癌藥物相互作用、耐藥修飾劑對(duì)細(xì)胞毒性的影響、體外新藥的篩選以及最終實(shí)現(xiàn)個(gè)體化療方面都有深入研究?jī)r(jià)值。Tomita K等研究表明，體外藥敏試驗(yàn)與體內(nèi)臨床用藥不敏感（陰性結(jié)果）相符合率均為90％。由此表明，不論是真陽(yáng)性及真陰性符合率，應(yīng)用具有簡(jiǎn)便、快速、敏感、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)的MTT法試驗(yàn)，對(duì)于制定臨床腫瘤合理化療策略具有指導(dǎo)意義。

本檢測(cè)結(jié)果顯示，不同患者大腸癌標(biāo)本對(duì)化療藥物的敏感程度有明顯的異質(zhì)性。3份未檢測(cè)到敏感藥物及藥物組合，4份檢測(cè)到對(duì)所有藥物及藥物組合均敏感。提示化療前進(jìn)行體外藥敏檢測(cè)，可篩選出患者相對(duì)敏感的藥物，以避免盲目用藥的損害。此外，試驗(yàn)顯示，大腸癌對(duì)單藥的敏感性普遍較差，對(duì)CPT、L-OHP和5-FU的中度敏感率分別為10.0%、7.5%和2.5%。此結(jié)果與大腸癌屬化療低度敏感的臨床觀(guān)察相符合。現(xiàn)在，臨床上多用2種或2種以上的藥物進(jìn)行聯(lián)合化療，但發(fā)表的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果多是單藥試驗(yàn)結(jié)果，這與臨床實(shí)際應(yīng)用有較大距離。因此，我們嘗試體外檢測(cè)臨床常用的三種藥物氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康單藥應(yīng)用、兩藥及三藥（全量或半量）聯(lián)合應(yīng)用的敏感性。結(jié)果顯示，不同標(biāo)本的藥物敏感性存在著明顯差異，單藥中有效的藥物依次為伊立替康、奧沙利鉑和氟尿嘧啶，敏感率分別為35.0%、27.5%和20.0%；兩藥聯(lián)合應(yīng)用均優(yōu)于各自單藥的抑制效果（P＜0.05），伊立替康聯(lián)合奧沙利鉑弱于伊立替康或奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯(lián)合的抑制效果（P＜0.05）；三藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制效果顯著優(yōu)于兩藥聯(lián)合（P＜0.05），三藥全量及半量聯(lián)合應(yīng)用效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

在本實(shí)驗(yàn)中，伊立替康、奧沙利鉑及氟脲嘧啶三藥聯(lián)合顯示了強(qiáng)大的抗腫瘤活性，明顯優(yōu)于伊立替康或奧沙利鉑與氟脲嘧啶的兩藥聯(lián)合的效果。Falcone等[5]進(jìn)行的一項(xiàng)Ⅲ期臨床研究表明，應(yīng)用伊立替康、奧沙利鉑及氟脲嘧啶三藥聯(lián)合的FOLFOXIRI方案治療晚期轉(zhuǎn)移性大腸癌顯示出較好的抗腫瘤活性，與伊立替康、氟脲嘧啶二藥聯(lián)合FOLFIRI方案相比在RR、PFS和OS均取得明顯的改善。

國(guó)外也有研究表明，三者聯(lián)合應(yīng)用可能通過(guò)協(xié)同作用而增強(qiáng)抗腫瘤效果。本實(shí)驗(yàn)顯示，半量與全量的三藥聯(lián)合組內(nèi)差異不顯著，既半量聯(lián)合可取得全量聯(lián)合應(yīng)用相同的效果。這種半量的化療方案可以在保證療效的前提下減少毒副作用，為臨床應(yīng)用三藥小劑量化療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但我們檢測(cè)藥敏的病例數(shù)較少，尚需更多的數(shù)據(jù)和進(jìn)一步研究，才能為臨床應(yīng)用提供更有價(jià)值的試驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2011-05-30）