宜昌部分地區(qū)高致病性豬藍(lán)耳病RT-PCR檢測

摘要：從宜昌部分地區(qū)豬散養(yǎng)戶中隨機(jī)抽取部分豬血樣及疑似高致病性豬藍(lán)耳病病例血樣共計(jì)１８１份，進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳?。遥裕校茫业臋z測，結(jié)果顯示２３份為陽性。試驗(yàn)初步證明，隨機(jī)抽取的１８１頭豬中有部分豬感染高致病性豬藍(lán)耳病病原。

關(guān)鍵詞：高致病性豬藍(lán)耳??；ＲＴ－ＰＣＲ；檢測

中圖分類號(hào)：Ｓ８５８．２８ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：１００７－２７３Ｘ（２０12）05-0012-01

高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（ＰＲＲＳＶ）引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。該病最早于１９８７年報(bào)道于美國南部，現(xiàn)已遍及世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［１］。

２００６年，我國暴發(fā)了一種以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的“豬高熱綜合征”［２］。宜昌地區(qū)也暴發(fā)了“豬高熱綜合征”，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖行業(yè)造成了巨大損失。后經(jīng)診斷為多病原混合感染，其中主要的病原就是高致病性豬藍(lán)耳病病原。本試驗(yàn)就是從當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場隨機(jī)抽取血樣進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳病病原學(xué)檢測，為高致病性豬藍(lán)耳病的預(yù)防和預(yù)警打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 試驗(yàn)材料

（１）豬全血。從宜昌部分豬場隨機(jī)抽取１８１份全血，編號(hào)為１－１８１。

（２）高致病性豬藍(lán)耳病陽性血清。

（３）引物。參照李彬等［２］的論文設(shè)計(jì)１對(duì)特異性引物。上游引物（Ｎｓｐ２Ｆ）序列為５’－ＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＣ－３’，下游引物（Ｎｓｐ２Ｒ）序列為５’－ＧＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＧＣＧ－３’。ＰＲＲＳＶ變異株和經(jīng)典毒株預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為４１８ｂｐ和５０８ｂｐ。

（４）主要試劑。ＲＮＡ提取試劑盒為美國ＯＭＥＧＡ公司產(chǎn)品；ＲＴ－ＰＣＲ試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品；低分子量蛋白質(zhì)Ｍａｒｋｅｒ、瓊脂糖為ＯＸＯＩＤ產(chǎn)品。

１．２ 試驗(yàn)方法

１．２．１ 病毒總ＲＮＡ的提取 采集的全血分離后收集血清，ＲＮＡ的抽提按試劑盒說明書進(jìn)行。

１．２．２ 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ） Ｖｅｒ ３．０ 說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于ＰＣＲ 反應(yīng)模板或－２０℃保存。

１．２．３ ＰＣＲ反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物１０μＬ，５×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １０．０ μＬ，上下游引物各０．５μＬ（２０μｍｏｌ／Ｌ），ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ０．２５μＬ（５ Ｕ／μＬ），用滅菌雙蒸水補(bǔ)充總體積至５０μＬ。ＰＣＲ 反應(yīng)條件為：９４℃ ５ ｍｉｎ變性；９４℃ １ ｍｉｎ，５７℃ １ ｍｉｎ，７２℃ １ ｍｉｎ，３５循環(huán)；７２℃ 延伸 １０ ｍｉｎ，４℃保存。

１．２．４ ＰＣＲ產(chǎn)物電泳檢測 ＰＣＲ產(chǎn)物在１％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長波紫外燈凝膠成像系統(tǒng)下觀察或拍照。

２ 結(jié)果

２．１ 高致病性豬藍(lán)耳病ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果

提取總ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳，陽性對(duì)照獲得大小為４１８ｂｐ左右的片段，與設(shè)計(jì)長度一致。部分上樣孔在４１８ｂｐ左右有帶（圖１）。

本試驗(yàn)共采集樣本１８１份進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳?。遥裕校茫业臋z測，結(jié)果顯示２３份為陽性。

２．２ 重復(fù)性試驗(yàn)

全部材料重復(fù)檢測一次，結(jié)果一致。

３ 討論

豬繁殖與呼吸綜合征是２０世紀(jì)８０年代后期在美國暴發(fā)的一種新型豬病毒性傳染病，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。以高致病性豬藍(lán)耳病為主要病原的高熱病席卷了我國南方多個(gè)省市，并以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為主要特征，重創(chuàng)了我國養(yǎng)豬行業(yè)。

近年來，宜昌市動(dòng)物疫情時(shí)有發(fā)生，特別是高致病性豬藍(lán)耳病給宜昌市畜牧業(yè)造成了一定的負(fù)面影響，為了更好地加強(qiáng)宜昌市動(dòng)物疫病的防控能力，提高對(duì)重大動(dòng)物疫病的預(yù)警、預(yù)報(bào)和診斷能力，筆者參考文獻(xiàn)［２］，建立了用ＲＴ－ＰＣＲ方法診斷高致病性豬藍(lán)耳病技術(shù)。該技術(shù)具有特異性和敏感性高、操作簡便、快速高效等特點(diǎn)，并且能區(qū)別高致病性豬藍(lán)耳病和普通藍(lán)耳病，為疫病的確診提供了有力保障。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 方六榮．豬繁殖與呼吸綜合征“自殺性”ＤＮＡ疫苗與活病毒載體疫苗研究［Ｄ］．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，２００３.

［２］ 李 彬，劉蘇燕，趙付偉，等． 豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株ＲＴ－ＰＣＲ檢測方法的建立與應(yīng)用［Ａ］． 第１０屆全國規(guī)?；i場主要疫病監(jiān)控與凈化專題研討會(huì)論文集［Ｃ］． 武漢：２００９．