垂穗披堿草MADS－box基因WM8克隆及分析

張妙青，張吉宇，劉志鵬，王彥榮，張磊

（草地農業生態系統國家重點實驗室 蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州730020）

生殖過程是高等植物生活史中最重要的階段，也是提高植物種子產量的關鍵時期。因此，與植物生殖密切相關的花器官的發育和種子成熟等一直是植物學家的研究重點之一。近年來，通過對雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）［1］、金魚草（Antirrhinummajus）［2］等花器官的研究，初步揭示了植物花發育遺傳調控的分子機制，提出了著名的花器官發育ABC模型［3，4］，后經進一步深入研究逐漸發展為 ABCDE模型［5－7］。ABCDE模型中大部分基因屬于MADS－box基因，它們編碼的轉錄因子調控不同基因的表達［8］。MADS－box基因具有高度保守的MADS－box結構域和半保守的能形成卷曲螺旋的K區［9］，主要決定花器官的形成，同時參與胚珠、種皮及果實發育的調控［10－13］。在整個被子植物中，MADS－box基因的功能是保守的，大部分都參與花發育的調控［14，15］。Zhao等［16］對小麥（Triticumaestivum）42個 MADS－box基因進行了分離以及比對分析，結果表明多種MADS－box基因存在于小麥組織中，以特定模式表達，對小麥的生長和發育可能起重要的作用。對水稻（Oryza sativa）75個MADS－box基因的研究表明，31個基因在水稻生殖階段優先積累，其中12個在種子、6個在穗部特定表達［17］。有關禾本科牧草相關基因的研究較少。Preston和Kellogg［18］重建了禾本科植物MADS－box轉錄因子FUL1和FUL2的進化史，并確定了其APETALA1／FRUITFULL－like基因序列和表達的演化。

垂穗披堿草（Elymusnutans）是禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）披堿草屬（Elymus）的多年生根莖疏叢型優質牧草，其抗寒能力強、粗蛋白含量高且適口性好［19，20］。主要分布在歐亞大陸和北美洲北部，垂直分布從海拔幾米的海灘一直到海拔5 200m以上的喜馬拉雅山區，我國西藏以及西北、華北等地區均有野生分布，是草原和草甸的重要組成部分［21］。我國西北高寒、濕潤地區，垂穗披堿草栽培較多，主要用于建植人工草地和放牧草地。近年來，對垂穗披堿草的種子產量、遺傳多樣性以及栽培放牧等方面的研究較多［22－25］，而關于MADS－box基因的研究多集中在擬南芥、金魚草等模式植物以及水稻、小麥等農作物中，很少涉及到草類植物，垂穗披堿草中的MADS－box基因尚未見報道。對垂穗披堿草中MADS－box基因的研究，不僅有助于闡明其控制花發育的分子機制，具有潛在的種子生產價值，而且作為麥類作物的野生近緣種遺傳資源，對于豐富麥類作物基因資源庫具有重要的經濟利用價值［26］。

1 材料與方法

1.1 材料

垂穗披堿草種子于2008年采自甘肅甘南草原，采集后保存在農業部牧草與草坪草種子質量監督檢驗測試中心（蘭州）低溫種子庫。2009年在蘭州大學草地農業科技學院盆栽，苗期采集幼嫩葉片，用液氮處理，然后置于－80℃ 超低溫保存備用。

PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa），RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN），DNA Marker，DNA 凝膠回收試劑盒，DH5α感受態細胞，pGM－T克隆試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。引物由北京賽百盛生物工程公司合成，其他試劑采用國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 的提取 參照 RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）使用說明，提取垂穗披堿草幼嫩葉片的總RNA，用紫外分光光度計Nanodrop進行RNA純度測定，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性。

1.2.2 引物設計 檢索 National Center for Biotechnology Information（簡稱 NCBI）上已公布的與垂穗披堿草近緣種的WM8及其同源基因的蛋白序列，多序列比對找出高度同源區域，用Primer Premier 5.0進行簡并引物設計，從垂穗披堿草擴增該基因的核心片段。上游引物為P1：5′ARWSNGARGGNAAYTGGT 3′，下游引物為P2：5′RCANACRTTYTGYTGNGG 3′，預測片段長度為449bp。

用獲得的該基因核心序列在NCBI上Blast，取相似性最高的全長序列，用Primer Premier 5.0設計引物，上游引物為P3：5′GCATCCCATCTCCCCTCACCG 3′，下游引物為P4：5′TAAGCCAAGCAGGTCATCCATGCTA 3′，以從垂穗披堿草擴增該基因的全長片段，預測片段長度為1 194bp。

1.2.3 cDNA第一條鏈的合成 參照PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa）使用說明，取2μL垂穗披堿草葉片總RNA，以Oligo dT為引物，進行cDNA第一條鏈的合成。第1步反應體系為10μL：dNTP Mixture（10 mmol／L each），1μL；Oligo（dT）Primer（2.5μmol／L），1μL；總 RNA 2μL；Rnase Free dH2O至10μL。反應為65℃5min。第2步反應體系為20μL：上述反應產物，10μL；5×PrimeScriptTMBuffer，4μL；Rnase Inhibitor（40 U／μL），0.5μL；PrimeScriptTMRTase（for 2step），0.5μL；Rnase Free dH2O 至20μL。反轉錄反應為42℃30 min，95℃5min。

1.2.4 cDNA核心序列的PCR擴增 以合成的cDNA第一鏈產物為模板，參照PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa）使用說明，PCR反應體系50μL：10×PCR Buffer，5μL；dNTP Mixture（10mmol／L），2μL；Ex Taq HS（5U／μL），0.5μL；引物P1和P2，各2μL；反轉錄的總cDNA 1μL；ddH2O補至50μL。反應程序：94℃預變性1min，然后以94℃30s，45℃30s，72℃1min進行35個循環，72℃延伸10min。取5μL擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 全長序列的PCR擴增 以合成的cDNA第一鏈產物為模板，參照 PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKa－Ra）使用說明，PCR反應體系50μL：10×PCR Buffer，5μL；dNTP Mixture（10mmol／L），2μL；Ex Taq HS（5 U／μL），0.5μL；引物P3和P4，各1μL；反轉錄的總cDNA，1μL；ddH2O補至50μL。反應程序：94℃ 預變性1 min，然后以94℃30s，58℃30s，72℃1min進行30個循環，72℃延伸10min。取5μL擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 測序、生物信息學分析以及蛋白結構分析 PCR產物進行瓊脂糖凝膠回收后連接在pGM－T載體上，轉化到DH5α感受態細胞中，Luria－Bertani（簡稱LB）固體培養基培養，藍白斑篩選挑取陽性克隆，通過PCR鑒定后送上海生工生物工程有限公司進行測序。

通過 NCBI（http：／／blast.ncbi.Nlm.nih.gov／Blast.cgi）網站進行 Blast檢索，利用 DNAMAN 6.0和Sequencher 4.9Demo生物技術軟件進行序列翻譯、多重比對以及同源樹等分析。

蛋白質的一級結構利用 ProtParam（http：／／us.expasy.org／cgi－bin／protparam）進行分析，包括氨基酸殘基數目、氨基酸組成、蛋白質相對分子質量、理論等電點以及疏水性等參數；利用TMHMM 2.0Serve（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）和 TMpred（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED）2個軟件同時對該蛋白序列的跨膜區域進行分析；用 PSORT WWW Server（http：／／psort.nibb.ac.jp／）中的 PSORT Prediction工具進行細胞定位。利用 NPSA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／）中的 MLRC程序在線分析蛋白質二級結構中α螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等結構的預測。通過Expasy（http：／／au.expasy.org／tools／）網站中Swiss－Model程序進行同源建模，推測垂穗披堿草WM8蛋白的三維結構。

圖1 垂穗披堿草總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis result of total RNA fromE.nutans

2 結果與分析

2.1 垂穗披堿草WM8基因全長序列的PCR擴增

用 RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）提取的垂穗披堿草葉片的總RNA（圖1），RNA 28S與18S條帶明顯，效果理想，滿足進一步實驗所需。

利用提取的總 RNA，PrimeScriptTMRT－PCR Kit（TaKaRa），以 Oligo（dT）為引物，進行反轉錄所得的產物為模板，以設計的引物P1、P2進行垂穗披堿草WM8基因核心片段的PCR擴增，獲得了與預期大小相符的條帶（圖2），經測序確認，片段長度為443bp。以引物P3、P4，進行其全長序列的PCR擴增，獲得了與預期大小相符的特異條帶（圖3），經測序確認，片段長度為1 196bp。由于所設計引物為同源比對保守區域，PCR擴增結果較為特異，大小亦與預期結果相符，雖有部分非特異性擴增條帶，但其濃度、大小均不符。

圖2 EnWM8基因cDNA核心序列電泳分析Fig.2 Electrophoresis of EnWM8gene cDNA core sequence fromE.nutans

圖3 EnWM8基因cDNA全長序列電泳分析Fig.3 Electrophoresis of EnWM8gene cDNA full length sequence fromE.nutans

2.2 EnWM8基因全序列分析

對分離得到的基因片段進行測序，獲得了一段完整的cDNA序列，全長1 196bp，其中包含一段828bp的開放閱讀框，編碼275個氨基酸殘基的蛋白質，具有典型的植物MADS－box基因的結構［8］。將此片段命名為En－WM8，在GenBank注冊，登錄號為JF683846。

從結構上可將EnWM8基因推導的氨基酸序列分成4個區（圖4），第1～61個氨基酸為高保守的MADS－box結構區域，是識別DNA順式作用元件并與之結合的一段氨基酸序列；第75～174個氨基酸為半保守的K區；位于MADS－box區和K區之間的部分為I區，是MADS－box區和K區的銜接部分；K區的下游為極不保守的C－末端。

將獲得的cDNA序列在NCBI上進行BLASTX比較，其編碼的蛋白質與其他多種植物MADS－box基因蛋白具有很高的同源性，其中與小麥的WM8（90%）、AGL29（95%）和大麥的MADS8（93%）相似性最高。En－WM8與二倍體小麥（T.aestivum）的TaWM8、TaAGL29、六倍體小麥（T.monococcum）的fruitful－like基因推導的氨基酸序列進行比對，相似性分別高達95.62%（262／274），96.72%（265／274）和96.28%（181／188）（圖5）。

EnWM8與小麥的50MADS基因、擬南芥的AtWM8及AtAGL29基因編碼的蛋白質序列經由DNAMAN軟件推演的系統進化樹顯示，不同組的基因被分到不同的分支，EnWM8屬于MIKC型MADS－box基因，與TaWM8進化關系最近，其次依次是TaAGL29、TaVRT－1、TaAGL10，與擬南芥的TaWM8、TaGL29進化關系較遠（圖6）。

圖4 EnWM8基因cDNA核苷酸序列和推導氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences for EnWM8gene cDNA fromE.nutans

圖5 垂穗披堿草的EnWM8與小麥的WM8、AGL29、fruitful－like基因氨基酸序列比對Fig.5 The comparison of the deduced amino acid sequences between EnWM8of E.nutans，WM8and AGL29of T.aestivum，fruitful－like of T.monococcum

2.3 垂穗披堿草WM8蛋白質結構分析

2.3.1 垂穗披堿草 WM8蛋白氨基酸序列分析 垂穗披堿草 WM8蛋白由275個氨基酸組成，分子量為13 726.7Da，理論等電點為9.14，是一個堿性蛋白。對其氨基酸組成的分析結果表明，該蛋白分子式為C1353H2192N412O427S14，原子總數為4 398。堿性氨基酸殘基總數（Arg＋Lys）為38，酸性氨基酸殘基總數（Asp＋Glu）為31。

2.3.2 垂穗披堿草WM8蛋白疏水性和跨膜分析以及細胞定位 垂穗披堿草WM8氨基酸序列疏水性分析表明，該蛋白的氨基酸中大部分為親水性氨基酸，疏水性的總平均值（GRAVY）為－0.935，所以該蛋白為親水性蛋白（圖7）。

利用TMHMM 2.0Server和TMpred對該蛋白跨膜區域進行分析，結果表明跨膜區域為0。跨膜區域中氨基酸序列的期望值大于18時，蛋白才有跨膜區域。該蛋白在跨膜區域中的氨基酸序列期望值僅為0.013 26。因此，垂穗披堿草WM8蛋白沒有跨膜區域。

通過PSORT WWW Server中的工具PSORT Prediction，對垂穗披堿草 WM8蛋白進行細胞定位顯示，該蛋白存在于細胞核（nucleus）中的可能性為76.0%，存在于過氧化物酶體（microbody peroxisome）、線粒體雜基空間（mitochondrial matrix space）和葉綠體類囊體膜（chloroplast thylakoid membrane）中的可能性較小，分別為30%，10%和10%。該蛋白是否存在于細胞壁膜間隙、外膜及內膜等都無法確定。

圖6 EnWM8與小麥50個MADS基因、AtWM8和AtAGL29序列系統進化樹分析Fig.6 Analysis of the phylogentic relationship among the deduced amino acid sequences of EnWM8，50MADS genes of T.aestivum，AtWM8and AtAGL29

2.3.3 垂穗披堿草 WM8蛋白二級和三級結構預測 通過 NPSA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／）對垂穗披堿草WM8蛋白的二級結構進行預測（圖8），分析預測結果顯示，垂穗披堿草WM8蛋白的二級結構中主要為α－螺旋、無規則卷曲和延伸鏈，所占比例分別為52.36%，37.82%和9.82%。可見，α－螺旋、無規則卷曲和延伸鏈構成了其二級結構的重要部分。

通過Expasy（http：／／au.expasy.org／tools／）網站中SwissModel程序對垂穗披堿草 WM8蛋白的三維空間結構進行了預測，結果表明（圖9），該蛋白的二級結構中主要為α－螺旋、無規則卷曲和延伸鏈，所占比例依次為α－螺旋最多，無規則卷曲次之，延伸鏈最少，無β－折疊存在。這與通過 NPSA（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／）對該蛋白進行的二級結構的預測結果一致。

圖7 垂穗披堿草WM8蛋白的疏水性分析Fig.7 The hydrophobicity analysis of WM8protein fromE.nutans

圖8 垂穗披堿草WM8蛋白的二級結構預測Fig.8 The secondary structure prediction of WM8protein fromE.nutans

圖9 垂穗披堿草WM8蛋白的三維結構預測Fig.9 The three－dimensional structure prediction of WM8protein fromE.nutans

3 討論

本研究根據MADS區設計簡并性引物，利用RT－PCR的方法獲得EnWM8基因cDNA片段，然后利用與NCBI上已公布的WM8及其同源基因的序列進行比對，選取與其相似性最高的全長序列設計特異引物，通過RT－PCR的方法克隆獲得了一段完整的cDNA序列，全長1 196bp，其中包含一段828bp的開放閱讀框，編碼275個氨基酸殘基的蛋白質，具有典型的高保守的MADS－box結構域以及半保守的K區，說明EnWM8是典型的MADS－box基因。

EnWM8推導的氨基酸序列與小麥的WM8、AGL29和fruitful－like相似性較高，分別為95.62%，96.72%和96.28%，且與小麥的50個 MADS－box基因、擬南芥的AtWM8及AtAGL29基因編碼的蛋白質序列經由DNAMAN軟件推演的系統進化樹顯示結果與其相符，同時也說明了垂穗披堿草與小麥親緣關系較近，而與擬南芥親緣關系較遠。另外，推演系統進化樹時還發現MADS－box基因5′端均高度保守，而3′末端變異較大，這也驗證了MADS－box基因家族典型的MADS－box結構域的存在。單子葉植物和雙子葉植物兩者花器官形態雖有所不同，但其各輪花器官亦可基本對應。就垂穗披堿草和擬南芥而言，水稻中的內外稃、漿片、雄蕊和心皮分別對應擬南芥中的萼片、花瓣、雄蕊和心皮，且MADS－box基因在單子葉植物和雙子葉植物中在結構和功能上都具有相當的保守性［14，27］。按系統進化分析，EnWM8屬于 MIKC型 MADS－box基因，且與小麥的WM8、AGL29和fruitful－like氨基酸序列相似性較高（均大于95%）。擬南芥中AGL29基因是控制花粉成熟及其競爭能力的下游調控因子［28］，而fruitful－like基因既在花發育早期促進花序分生組織的形成，又在花發育的晚期影響心皮的形成及角果的開裂，同時還影響葉片的發育［29］。據此推測WM8基因與它們的功能相似。然而，關于MADS－box基因WM8的研究很少，僅在擬南芥、小麥等植物中少有報道［15］，其具體基因功能更是未明，有待于進一步研究。

利用生物信息學分析軟件對垂穗披堿草WM8蛋白的結構分析結果顯示，主肽鏈由275個氨基酸組成，理論等電點為9.14，蛋白分子量為31 511.7Da，分子式為C1353H2192N412O427S14，是一個堿性蛋白。蛋白質疏水性預測中，GRAVY值的范圍是－2～2，正值表明該蛋白為疏水性蛋白，負值表明為親水性蛋白。利用ProtParam工具統計的GRAVY為－0.935，所以垂穗披堿草WM8蛋白質為親水性蛋白質。對垂穗披堿草WM8蛋白二級結構的分析發現，該蛋白可以形成α－螺旋、無規則卷曲和延伸鏈，所占比例分別為52.36%，37.82%和9.82%。不同的氨基酸，對于形成不同的二級結構有著不同的能力。異亮氨酸、纈氨酸及蘇氨酸等有分枝的氨基酸，通常采用β－折疊的形態。脯氨酸對于α－螺旋的穩定性有一定的破壞能力。而在垂穗披堿草WM8蛋白中，這些氨基酸的含量較少，因此形成β－折疊的可能性也較小，這可能是相當比例的無規則卷曲出現的原因。該蛋白堿性氨基酸含量大于酸性氨基酸含量，因此其等電點較高（pI為9.14）。垂穗披堿草WM8蛋白通過生物信息軟件分析，沒有N端信號肽，也沒有跨膜結構，因此可以預測該蛋白可能定位于細胞質和細胞核中。通過PSORT WWW Server中的工具PSORT Prediction對垂穗披堿草WM8蛋白進行細胞定位，結果顯示，該蛋白存在于細胞核中的可能性為76.0%，與上述預測一致。對該蛋白的二級和三級結構分析可知，該蛋白富含α－螺旋和無規則卷曲結構，因此，該蛋白的主要功能很可能由這些結構承載。

總之，本研究從垂穗披堿草中分離獲得了EnWM8基因的全長cDNA序列，并進行了系統的序列分析以及蛋白結構分析，不僅為進一步研究EnWM8基因在垂穗披堿草中的表達分析、功能驗證、蛋白的分子結構與功能的關系等奠定了基礎，且可為深入研究垂穗披堿草的花發育、種子成熟等機制提供參考。

［1］Bowman J L，Smith D R，Meyerowitz E M.Genetic interaction among floral homeotic genes ofArabidopsisthaliana［J］.Development，1991，112：1－20.

［2］Coen E S，Meyerowitz E M.The war of the whorls：genetic interactions controlling flower development［J］.Nature，1991，353：31－37.

［3］Meyerowitz E M，Bowman J L，Brockman L L，etal.A genetic and molecular model for flower development inArabidopsisthaliana［J］.Development，1991，112（Suppl.1）：157－167.

［4］Weigel D，Meyerowitz E M.The ABCs of floral homeotic genes［J］.Cell，1994，78：203－209.

［5］Honma T，Goto K.Complexes of MADS－box proteins are sufficient to convert leaves into Xoral organs［J］.Nature，2001，409：525－529.

［6］Theissen G.Development of Xoral organ identity：stories from the MADS house［J］.Current Opinion in Plant Biology，2001，4：75－85.

［7］Zahn L M，Kong H，Leebens－Mack J H，etal.The evolution of theSEPALLATAsubfamily of MADS－box genes：apreangiosperm origin with multiple duplications throughout angiosperm history［J］.Genetics，2005，169：2209－2223.

［8］Soltis D E，Ma H，Frohlich M W，etal.The floral genome：an evolutionary history of gene duplication and shifting patterns of gene expression［J］.Trends in Plant Science，2007，12（8）：358－367.

［9］Ma H，Yanofsky M F，Meyerowitz E M.AGL1－AGL6，anArabidopsisgene family with similarity to floral homeotic and transcrip tion factor genes［J］.Genes and Development，1991，5：484－495.

［10］Prasad K，Zhang X，Tobon E，etal.TheArabidopsisB－sister MADS－box protein，GORDITA，represses fruit growth and contributes to integument development［J］.The Plant Journal，2010，62（2）：203－214.

［11］Jang S，Marchal V，Panigrahi K C，etal.TheArabidopsisCOP1shapes the temporal pattern of CO accumulation conferring aphot operiodic flowering response［J］.The EMBO Journal，2008，27（8）：1277－1288.

［12］Becker A，Theissen G.The major clades of MADS－box genes and their role in the development and evolution of flowering plants［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，29：464－489.

［13］de Bodt S，Raes J，van de Peer Y，etal.And then there were many：MADS genes genomic［J］.Trends in Plant Science，2003，8：475－410.

［14］Riechmann J L，Meyerowitz E M.MADS domain proteins in plant development［J］.Biological Chemistry，1997，378：1079－1101.

［15］Paolacci A R，Tanzarella O A，Porceddu E，etal.Molecular and phylogenetic analysis of MADS－box genes of MIKC type and chromosome location of SEP－like genes in wheat（TriticumaestivumL.）［J］.Molecular Genetics and Genomics，2007，278：689－708.

［16］Zhao T，Ni Z F，Dai Y，etal.Characterization and expression of 42MADS－box genes in wheat（TriticumaestivumL.）［J］.Molecular Genetics and Genomics，2006，276：334－350.

［17］Arora R，Agarwal P，Ray S，etal.MADS－box gene family in rice：genome－wide identification，organization and expression profiling during reproductive development and stress［J］.BMC Genomics，2007，8：242.

［18］Preston J C，Kellogg E A.Reconstructing the evolutionary history of paralogousAPETALA1／FRUITFULL－Like genes in grasses（Poaceae）［J］.Genetics，2006，174：421－437.

［19］袁春光.青藏高原野生優質牧草：垂穗披堿草［J］.草業與畜牧，2005，（10）：62.

［20］周永紅，鄭有良，楊俊良，等.10種披堿草屬植物的RAPD分析及其系統學意義［J］.植物分類學報，1999，37（5）：425－432.

［21］嚴學兵，周禾，郭玉霞，等.披堿草屬植物形態多樣性及其主成分分析［J］.草地學報，2005，13（2）：27－32.

［22］謝國平，呼天明，王佺珍，等.施N量和收獲時間對西藏野生垂穗披堿草種子產量影響研究［J］.草業學報，2010，19（2）：89－96.

［23］張妙青，王彥榮，張吉宇，等.垂穗披堿草種質資源繁殖相關特性遺傳多樣性研究［J］.草業學報，2011，20（3）：182－191.

［24］趙忠，何毅，賈生福，等.肅北縣草原資源調查［J］.草業科學，2010，27（11）：53－65.

［25］楊松，李春杰，柴青，等.披堿草內生真菌對三種草坪草種子與種苗的化感效應［J］.草業學報，2010，19（4）：33－40.

［26］張建波.川西北高原野生垂穗披堿草遺傳多樣性研究［D］.成都：四川農業大學，2007：1－17.

［27］王力娜，范術麗，宋美珍，等.植物 MADS－box基因的研究進展［J］.生物技術通報，2010，（8）：12－19.

［28］Verelst W，Twell D，de Folter S，etal.MADS－complexes regulate transcriptome dynamics during pollen maturation［J］.Genome Biology，2007，8：249.

［29］Mandel M A，Yanofsky M F.TheArabidopsisAGL8MADS box gene is expressed in inflorescence meristems and is negatively regulated byAPETALA1［J］.Plant Cell，1995，7：1763－1771.