SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鑒定

何一，王崇樹(shù)，魏壽江，王攀

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鑒定

何一，王崇樹(shù)△，魏壽江，王攀

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川 南充 637000)

目的:建立多藥耐藥人胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型并探討移植瘤的耐藥特性。方法:將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和耐藥細(xì)胞株SGC-7901/HCPT分別接種于裸小鼠左側(cè)背部皮下和右側(cè)背部皮下，在SPF級(jí)動(dòng)物合格環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察腫瘤細(xì)胞成瘤情況，用MTT法比較移植瘤細(xì)胞對(duì)羥基喜樹(shù)堿的敏感性及免疫組化測(cè)定其耐藥基因TOPO-Ⅰ表達(dá)的變化。結(jié)果:SGC-7901和SGC-7901/HCPT裸小鼠移植成瘤率為100%，無(wú)自行消退現(xiàn)象。MTT法測(cè)定SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分別為4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，與移植前細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。耐藥基因TOPO-Ⅰ表達(dá)分別為2.964±0.162和2.953±0.172，差異無(wú)著性意義。結(jié)論:以SGC-7901/HCPT細(xì)胞建立的裸鼠皮下耐藥移植瘤模型，仍保持體外的耐藥活性和基因表型，為耐藥機(jī)制和逆轉(zhuǎn)的研究提供了良好的動(dòng)物模型。

胃腫瘤;腫瘤移植;動(dòng)物

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成腫瘤化療失敗的主要原因［1］。為此我們利用胃癌耐羥基喜樹(shù)堿細(xì)胞株SGC-7901/HCPT成功接種于裸小鼠，建立體內(nèi)腫瘤耐藥模型并對(duì)其耐藥特性進(jìn)行初步研究，為腫瘤耐藥機(jī)制研究和逆轉(zhuǎn)耐藥藥物的篩選提供一個(gè)體內(nèi)模型。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室惠贈(zèng)，人胃癌耐羥基喜樹(shù)堿細(xì)胞株SGC-7901/HCPT由本課題組采用逐步增加藥物劑量的方法誘導(dǎo)建立［2］。常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞備用。BALB/C(nu，nu)裸小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雌雄皆用，4～5周齡，體重21～25 g，在SPF級(jí)動(dòng)物合格環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 試劑

RPMI-1640干粉培養(yǎng)基:美國(guó)GIBICO公司生產(chǎn);小牛血清:成都哈里生物工程有限公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑鹽(MTT):美國(guó)Sigma公司生產(chǎn);超凈工作臺(tái):蘇凈集團(tuán)安泰公司制造;二氧化碳孵育箱:美國(guó)Forma Scientific Inc生產(chǎn);倒置熒光顯微鏡:日本Olympus生產(chǎn);自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀:日本Microplate header生產(chǎn);兔抗人TOPO-Ⅰ多克隆抗體購(gòu)于博士德生物有限公司;免疫組化試劑盒和DAB試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 裸小鼠皮下移植瘤模型的建立

將親代SGC-7901接種于裸小鼠左側(cè)背部皮下，耐羥基喜樹(shù)堿細(xì)胞系SGC-7901/HCPT接種于裸小鼠的右側(cè)背部皮下，接種濃度均為1×107/mL，劑量為0.3 mL。接種第6～9天，可見(jiàn)裸小鼠接種部位長(zhǎng)出腫塊，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按下面公式計(jì)算腫瘤體積:V=2/3×a×b。2周后，當(dāng)包塊約1.0 cm大小，取出包塊，去除周?chē)w維組織，用篩網(wǎng)法制備單細(xì)胞懸液，將其接種另一只裸小鼠的背部皮下，待腫瘤包塊長(zhǎng)至約1.0 cm大小，取出，重復(fù)上述操作計(jì)4次。

1.4 細(xì)胞毒試驗(yàn)(MTT)

在第四次腫瘤接種后3周處死裸小鼠，無(wú)菌條件下分離腫瘤組織，將新鮮瘤塊用篩網(wǎng)法制備成單細(xì)胞懸液并接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，將上述細(xì)胞和接種裸鼠前的細(xì)胞于指數(shù)增長(zhǎng)期接種于96孔板，每孔含細(xì)胞104個(gè)，平行3孔，各孔定容200 μL/孔，實(shí)驗(yàn)孔加羥基喜樹(shù)堿，wild SGC-7901和SGC-7901/nude分別加入A(0.1 μg/mL)、B(0.2 μg/mL)、C(0.4 μg/mL)、D(0.8 μg/mL)、E(1.6 μg/mL)五個(gè)濃度水平，每孔20 μL;wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nudeA分別加入(1 μg/mL)、B(2 μg/mL)、C(4 μg/mL)、D(8 μg/mL)、E(1.6 μg/mL)五個(gè)濃度水平。每孔20 μL，培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/L)，4 h后棄上清并加入DMOS(150 μL/孔)，充分振蕩10 min，使結(jié)晶顆粒溶解，用酶標(biāo)儀在590 nm處測(cè)定吸光度值(A)，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率(抑制率=1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)。

1.5 免疫組化測(cè)定TOPO-Ⅰ表達(dá)情況

在第四次腫瘤接種后3周處死裸小鼠，無(wú)菌條件下分離腫瘤組織，將新鮮瘤塊用篩網(wǎng)法制備成單細(xì)胞懸液，制細(xì)胞爬片，行免疫組化(S-P)法檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明操作。結(jié)果判斷:排除爬片邊緣細(xì)胞，10×10低倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)細(xì)胞分布視野，每個(gè)視野在10×20中倍鏡下記數(shù)50個(gè)細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)弱分為四個(gè)等級(jí)，無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分［3］。按公式HSCORE=∑Pi(I+1)(i=0、1、2、3…;Pi表示評(píng)分為I的比例)計(jì)算HSCORE得分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 初代移植和傳代成功率

SGC-7901和SGC-7901/HCPT兩株胃癌細(xì)胞分別接種裸鼠于裸小鼠左側(cè)背部皮下和右側(cè)背部皮下，在裸小鼠左側(cè)背部皮下和右側(cè)背部皮下可見(jiàn)到腫瘤結(jié)節(jié)形成，取出移植瘤進(jìn)行傳代，移植成功率達(dá)到100%。尚未發(fā)現(xiàn)移植瘤有自發(fā)性消退現(xiàn)象。

2.2 裸小鼠移植瘤的耐藥特性

為了明確SGC-7901/HCPT裸小鼠移植瘤經(jīng)體外培養(yǎng)檢測(cè)是否仍保持對(duì)羥基喜樹(shù)堿耐藥的特性，取裸小鼠移植腫瘤組織無(wú)菌條件下制成分離細(xì)胞，與羥基喜樹(shù)堿對(duì)原代細(xì)胞的細(xì)胞毒作用進(jìn)行比較，結(jié)果(表1)表明裸小鼠Wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分別為4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，與移植前細(xì)胞比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SGC-7901/HCPT/nude細(xì)胞與SGC-7901/nude細(xì)胞對(duì)HCPT的耐藥指數(shù)

2.3 裸小鼠移植瘤的耐藥表型

為了明確SGC-7901/HCPT裸小鼠移植瘤是否具有耐羥基喜樹(shù)堿的耐藥表型，對(duì)移植瘤腫瘤免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TOPO-Ⅰ表達(dá)水平，結(jié)果表明同移植前體外培養(yǎng)的Wild SGC-7901/HCPT細(xì)胞相比，SGC-7901/HCPT/nude細(xì)胞也具有TOPO-Ⅰ表達(dá)水平下降，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SGC-7901/HCPT/nude仍保留耐羥基喜樹(shù)堿的基因表型，見(jiàn)表2。

表2 SGC-7901和SGC-7901/HCPT的TOPO-Ⅰ的表達(dá)情況

3 討論

體內(nèi)建立耐藥動(dòng)物模型，一般有移植耐藥細(xì)胞株瘤或腫瘤組織(移植型)和荷瘤動(dòng)物給藥誘導(dǎo)耐藥(誘導(dǎo)型)兩種方式。由于荷瘤動(dòng)物給藥誘導(dǎo)耐藥，操作復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，受荷瘤動(dòng)物生存時(shí)間的限制，應(yīng)用較少，目前實(shí)驗(yàn)研究多采用移植方式。實(shí)體瘤耐藥移植瘤模型多采用皮下移植和原位移植兩種途徑，通常認(rèn)為原位移植優(yōu)于皮下移植模型，主要是由于能夠模擬體內(nèi)的器官微環(huán)境，雖能更好的反映腫瘤的形態(tài)特點(diǎn)和生物學(xué)行為，但由于操作復(fù)雜，創(chuàng)傷性大，每次接種數(shù)量有限，腫瘤深藏，不利于觀察和治療，應(yīng)用受到一定程度的限制。而皮下移植腫瘤操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷性小，腫瘤淺表便于觀察和治療，可以擴(kuò)大接種數(shù)量。翟寶進(jìn)等［4］比較肝癌細(xì)胞系HepG2接種裸小皮下和肝原位移植兩種模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多藥耐藥特性并無(wú)顯著性差異，提示皮下移植腫瘤與原位移植模型具有相似的生物學(xué)行為，利于腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選觀察。

本研究結(jié)果表明，以具有耐羥基喜樹(shù)堿為特征的SGC-7901/HCPT胞建立的裸鼠移植瘤模型，不僅成瘤率高(達(dá)100%)，而且在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)良好。SGC-7901/nude的IC50為0.496 μg/mL，SGC-7901/HCPT/nude的IC50為4.381 μg/mL，表明在體內(nèi)情況下，移植瘤SGC-7901/HCPT/nude仍保持體外的耐藥指數(shù)。wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分別為4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，表明移植瘤對(duì)羥基喜樹(shù)堿的耐藥倍數(shù)保持穩(wěn)定。耐藥基因TOPO-Ⅰ的表達(dá)下降，則可能是SGC-7901/HCPT耐HCPT形成的分子基礎(chǔ)［5－7］，SGC-7901/HCPT/nude與SGC-7901/nude比較，TOPO-Ⅰ表達(dá)水平下降，表明體內(nèi)腫瘤SGC-7901/HCPT/nude仍具有耐藥基因的表型，而TOPO-Ⅰ在SGC-7901/HCPT/nude與wild SGC-7901/HCPT中的表達(dá)差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，表明移植瘤仍保持與體外相似的耐藥基因表型。

綜上所述，SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤腫瘤能保持在體外培養(yǎng)條件下的耐藥特性，其對(duì)羥基喜樹(shù)堿的耐藥倍數(shù)和耐藥基因表型未產(chǎn)生改變，為建立人類(lèi)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥動(dòng)物模型提供借鑒，亦為體內(nèi)腫瘤耐藥機(jī)制以及逆轉(zhuǎn)耐藥的研究提供良好的動(dòng)物平臺(tái)。

［1］Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer:an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein［J］.Cancer Control，2003，10(2):159－165

［2］何一，王崇樹(shù)，魏壽江，等.人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC-7901/HCPT的耐藥機(jī)制初探［J］.四川腫瘤防治，2007，20(1):10－12

［3］Harrington DJ，Lessey BA，Rai V，et al.Tenascin is differentially expressed in endometrium and endometriosis［J］.J Pathol，1999，187(2):242－248

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The creation and identification of SGC-7901/HCPT cell hetero-transplanted models in nude mice

HE Yi，WANG Chong-shu△，WEI Shou-jiang，WANG Pan
(Department of General Surgery，Affiliated Hospital of North SichuanMedical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

Objective:To establish multi-drug resistance human gastric cancer cell hetero-transplanted models in nude mice and to explore its multi-drug resistance characteristics.Methods:Human gastric cancer cell line SGC-7901 and resistant cell lines SGC-7901/HCPT were inoculated in the left and right subcutaneous part of these nude mouse respectively reared in the SPF level of qualified animal environment.Observed transplanted tumor’growth was compared with the MTT method HCPT tumor cell sensitivity and immunohistochemical determination of the resistance gene expression in TOPO-Ⅰ.Results:SGC-7901 and SGC-7901/HCPT nude mice tumor formation rate was 100%with no self-limiting phenomenon.The growth rate showed no significant difference.Determination SGC-7901/HCPT and SGC-7901/HCPT/nude MTT，IC50 4.686 μg/mL and 4.381 μg/mL，compared with the cells before transplantation showed no significant difference，resistance gene expression by TOPO-Ⅰwas 2.964±0.162 and 2.953±0.172.The difference was not significant meaning.Conclusion:The SGC-7901/HCPT cells established in nude mice xenograft model of subcutaneous resistance had resistance remaining active and in vitro phenotype for the reversal of drug resistance mechanisms and provide a good animal model.

Stomach Neoplasm;Neoplasm Transplantation;Animals

1005-3697(2012)06-0559-03

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.010

四川省科技廳基金項(xiàng)目(02SC02－077)

2012-08-29

何一(1974－)，男，四川西充人，碩士，講師，主要從事胃腸腫瘤研究。

△通訊作者:王崇樹(shù)，E-mail:sichuanheyi@126.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2012-11-1217∶11

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1711.016.html