缺血-再灌注對股骨頭關節軟骨細胞分化及基質穩定性的影響

杜志昭，陳海英

(1.福建漳州衛生職業學院，福建 漳州 363000;2.福建莆田學院，福建 莆田 351100)

缺血-再灌注對股骨頭關節軟骨細胞分化及基質穩定性的影響

杜志昭1，陳海英2

(1.福建漳州衛生職業學院，福建 漳州 363000;2.福建莆田學院，福建 莆田 351100)

目的:探討缺血-再灌注對股骨頭關節軟骨退行性變的影響。方法:建立髖關節缺血再灌注模型，大鼠隨機分為正常組、模型組。于術后不同時點取股骨頭關節軟骨進行蘇木精-伊紅染色觀察缺血-再灌注后股骨頭關節軟骨的病理組織學結構改變;利用Van Gieson膠原纖維染色法觀察膠原纖維沉積變化;觀察VEGFmRNA原位雜交表達。結果:關節軟骨形態結構逐漸紊亂，再灌注后軟骨細胞明顯減少，差異均有顯著性意義(P﹤0.01)。結論:缺血-再灌注可加重股骨頭關節軟骨的損傷，細胞增殖活性下降及細胞環境不穩定可能是缺血－再灌注早期股骨頭關節軟骨損傷的重要機制。

缺血-再灌注;關節軟骨;軟骨細胞;膠原纖維;VEGFmRNA;原位雜交

缺血性損傷是由急性血液供應障礙而導致細胞壞死引起。臨床上發現當缺血的關節軟骨恢復血液供應后，關節軟骨損傷卻仍在繼續，并且有加重的現象，即缺血－再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷。I/R是血供重新恢復后給機體帶來的進一步損傷，是骨科和創傷外科的研究熱點，目前對心、肝、脾、腎等臟器損傷研究較多，但對關節軟骨I/R損傷的研究很少，軟骨組織內不含血管，不象其他器官容易遭受缺血的影響，使得I/R損傷的研究進展緩慢［1－4］。本文僅對I/R關節軟骨的軟骨細胞及細胞環境的穩定性進行研究探討，實驗從細胞增殖狀況、Van Gieson氏膠原纖維染色、VEGF原位雜交等代謝水平等觀察I/R關節軟骨的軟骨細胞增殖及細胞分布、基質代謝等方面對關節軟骨的修復作用。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠股骨頭骨骺I/R損傷的動物模型

清潔級4月齡健康成年SD大鼠，體重200～220 g，購自福建醫科大學動物室(動物合格證號:閩實動質準第2002－0006號)。雌雄不拘，塑料代謝籠分籠、普通塊料飼養，飲自來水。將大鼠隨機分為正常組(CON)10只;模型組(DM)20只。采用髂總動脈阻斷開放法建立大鼠股骨頭骨骺I/R模型:分離髂總動脈，在兩側髂總動脈分叉處以下用無創血管夾夾閉左側髂總動脈，到達再灌注時間點后松開血管夾，分別記錄缺血和再灌注時間。2組分別在缺血5 h、24 h組再灌注，每組在再灌注后即刻、24 h、168 h分批麻醉下處死實驗大鼠，每組每個時間點6只，正常組在實驗條件下即刻處死動物取標本，實驗中標本均取自實驗側。將標本分為2份。

1.2 關節軟骨標本的制備，組織學觀察及圖像分析

標本放入4%多聚甲醛溶液中固定24～36 h，逐級脫水脫脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，石蠟包埋切片，酸處理、烘干后用多聚賴氨酸包被干燥，觀察軟骨細胞與細胞外基質分布。

1.3 關節軟骨組織計量學指標比較

關節軟骨切片在普通顯微鏡下，進行軟骨細胞密度測定:鏡下計算每1 mm×1 mm關節軟骨中軟骨細胞的數量。同樣要求在不同10個視野各測定一次，取平均值。

1.4 Van Gieson氏膠原纖維染色

關節軟骨脫鈣，包埋、切片，以Van Gieson氏進行膠原纖維染色，光鏡下觀察膠原纖維沉積情況。選擇有意義的組織相片，經登錄、編號、采集、分析、讀取數據、存盤。在每張切片關節軟骨下區各隨機選10個視野測定，用圖像分析儀測定單位面積內膠原纖維沉積情況。

1.5 VEGF原位雜交表達

按照VEGFmRNA寡核苷酸探針雜交試劑盒(武漢博士德)，具體步驟操作，DAB顯色、蘇木素復染;顯微鏡觀察，圖象分析。探針序列(河北博海公司提供):5'-GCTCT ACCTC CACCA TGCCA AGTGG TCCCA-3'，5'-GACCC TGGTG GACAT CTTCC AGGAG TACCC-3'，5'-GCAGC TTGAG TTAAA CGAAC GTACT TGCAG-3'陰性對照:原位雜交過程用預雜交液替代探針工作液，其余步驟同上雜交試劑盒。光鏡下選擇生長板結構進行觀察。

光鏡下分別選擇股骨頭關節軟骨結構進行觀察、照相、編號、采集、分析存盤。

1.6 統計學分析

統計學分析測定和計量數據采用SPSS13.0統計軟件進行，采用兩個獨立樣本t檢驗，比較組間差異，P﹤0.05表示差異有統計學意義。所有數據均用均值±標準差±s)表示。

2 結果

2.1 HE染色關節軟骨病理組織學改變

正常組關節軟骨較厚，軟骨細胞清晰(圖1)。I/R早期關節腫脹，滑膜在關節緣粘連，軟骨表面失去光澤，彈性差。以再灌注168 h后較明顯。光鏡下所見:缺血期間關節滑膜水腫，少量炎細胞浸潤，再灌注后還可見細胞變性、壞死。單純缺血5 h及24 h，缺血期間關節軟骨變化不明顯，以后隨著時間的延長部分軟骨細胞出現核碎裂。再灌注24 h后軟骨細胞輕度腫脹，排列疏松，細胞變性明顯。再灌注168 h骺板軟骨細胞較多核碎裂，并部分核溶解。再灌注后24 h、168 h(圖2)和再灌注后即刻比較，其軟骨細胞密度差異均有統計學意義(P﹤0.01)(圖3)。

2.2 Van Gieson氏膠原代謝結果

正常組大鼠關節軟骨的軟骨細胞間質染色較淺，膠原纖維均勻分布，排列方向有序(圖4)。缺血5 h再灌注24 h后，觀察到關節軟骨的退行性改變，軟骨基質膠原纖維增多。缺血24 h再灌注后24 h、168 h其軟骨細胞間質染色較深，膠原纖維增多(圖5)，和再灌注后即刻、正常組比較差異均有統計學意義(P﹤0.01)(圖6)。

2.3 VEGF原位雜交表達及灰度值結果分析

正常組VEGFmRNA主要表達在關節軟骨的軟骨細胞中，表現為軟骨細胞胞漿和胞膜著色，DAB顯色為棕黃色(圖7)。缺血5 h再灌注24 h后，觀察到VEGFmRNA表達的陽性細胞數增多。缺血24 h再灌注后24 h、168 h其VEGFmRNA表達的陽性細胞數增多、增強(圖8)。與再灌注后即刻、正常組比較差異均有統計學意義(P﹤0.01)(圖9)。

3 討論

關節軟骨損傷后同其他組織損傷一樣，出現梗死面積和血流動力學指標及活性物質釋放的改變［5－8］，面臨重建問題。當關節軟骨缺血性損傷發生時，一方面要實施恢復血流的再灌注，另一方面還要考慮到因再灌注而造成的細胞增殖能力下降。缺血10 h再灌注168 h，關節軟骨細胞則可發生核碎裂;當缺血24 h再灌注168 h時，關節軟骨細胞則可發生核溶解。這一結果初步表明，I/R可引起骨細胞的損傷，同時隨著I/R時間的延長，關節軟骨細胞的損傷逐漸加重，軟骨細胞僅維持較低水平的新陳代謝。關節軟骨細胞的營養與軟骨基底的血供有關［9］，關節軟骨的營養來源只有靠關節液來維持，與其他組織I/R比較，軟骨細胞的易損性明顯增加。關節I/R損傷時關節軟骨損害的具體機制目前不確切，可能當關節缺血后，關節滑膜和軟骨下供血障礙，導致軟骨的營養及代謝失調，打破了軟骨合成和分解之間的平衡，使關節軟骨的分解代謝大于合成代謝。而滑膜的缺血更加影響了滑液的分泌，進一步加重了軟骨的損傷。同時肢體I/R損傷時可以產生大量的氧自由基、炎性細胞因子(白細胞介素1、腫瘤壞死因子α)等［10－11］。軟骨明顯增厚也是一種損傷表現，可能因股骨頭軟骨靠關節液營養的同時也因軟骨下血管受缺血再灌注損傷有關。

另本實驗中膠原纖維沉積增多，這可能是實驗中未發現軟骨細胞增生修復、而促進軟骨細胞內氨基酸蓄積，刺激骨膠原合成。這可能與觀察時間太短有關，即后期表現為膠原等細胞外基質成分表達的減少，這些問題有待于進一步研究。

VEGFmRNA是一種作用于動靜脈與淋巴管內皮細胞的二聚糖蛋白類絲裂原，與組織損傷修復和功能恢復密切相關。VEGFmRNA作用的靶細胞關節軟骨細胞可以合成并表達VEGFmRNA。VEGFm-RNA是軟骨細胞生長活性可靠指標，能夠很好反映其所處的代謝狀態。VEGFmRNA表達趨勢完全能夠體現關節軟骨細胞所合成分泌的VEGF的生物學效應。缺血性損傷時體內代謝紊亂和糖毒作用，組織廣泛缺血缺氧，導致多種細胞因子和生長因子可上調VEGFmRNA水平或誘導VEGF釋放。病程中持續高效地分泌VEGF、纖維蛋白等進入細胞外基質，協同加快軟骨轉換。實驗說明在軟骨重建作用較強的組織中，軟骨細胞為適應軟骨重建的需要而發生細胞增殖功能下降現象越明顯，并且在形態學、生化學及各種分子標記技術方面得到證實。軟骨組織通過某些基因，誘導和調控細胞增殖能力，使需要重建的軟骨細胞和骨基質，達到一種最佳的平衡狀態以適應機體活動的需要。

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Ischemia-reperfusion on femoral head articular cartilage cell differentiation and environmental stability

DU Zhi-zhao1，CHEN Hai-ying2
(1.Zhangzhou health Career Technical College，Zhangzhou 363000;2.Putian College，Putian 351100，Fujian，China)

Objective:TO study effect of ischemia-reperfusion by articular cartilage degeneration upon femoral-head.MethodsEstablish the hip joint of is chemia reperfusion model the rats.The rats were random divided into the normal groups and the model groups.In the postoperative time points From the articular cartilage of femoral head，Observe the structure of articular cartilage including cartilage cells，the change of collagen and the expression of VEGFmRNA by HE，Van Gieson，and in Situ Hybridization.ResultsThe model rats'articular cartilage developed with the course of illness，disordered structure，the cartilage cells became few and.small，fiber rose.The expression of VEGFmRNA reduced，the microvessel density enlarged.Conclusion:With the extension of the course，Ischemia reperfusion can exacerbate of articular cartilage of femoral head injury，Cell apoptosis and environmental instability may be ischemia reperfusion of early femoral head articular cartilage injury mechanism.

Ischemia reperfusion;Articular cartilage;Cartilage cells;Collagen;VEGFmRNA;In Situ Hybridization

1005-3697(2012)06-0562-04

R684

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.011

福建省教育廳科研項目(JB08222)

2012-10-12

杜志昭(1968－)，男，福建漳州人，講師。主要從事解剖學與組織胚胎學教學與科研工作。E-mail:chhyzw@163.com

時間:2012-11-1217∶34

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.201201112.1734.030.html

(學術編輯:謝勇恩)