重組人紅細(xì)胞生成素對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖和分泌MCP-1的影響

王 蕾

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院泌尿內(nèi)二科，山東 泰安 271000)

促紅細(xì)胞生成素(EPO)主要是由成人腎臟產(chǎn)生的一種糖蛋白激素，能特異性地作用于哺乳動(dòng)物的紅系祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化并抑制其凋亡。近年來，EPO的細(xì)胞保護(hù)作用和器官保護(hù)作用備受關(guān)注，EPOR不僅存在于紅系生成細(xì)胞，還存在于全身各組織器官。重組人紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)被認(rèn)為是一種全身性的、心血管系統(tǒng)和肢體保護(hù)性細(xì)胞因子。其中rHuEPO對神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)研究較多，本實(shí)驗(yàn)通過體外系膜細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，給予高糖環(huán)境下rHuEPO刺激，觀察對細(xì)胞的增殖和分泌MCP-1的影響。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠MCs購自HBZY-1；rHuEPO購自沈陽三生有限公司；10%胎牛血清為杭州四季清生物工程材料有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒由日本同仁化學(xué)研究所提供。大鼠MCP-1引物及探針由上海英俊生物有限公司提供，Trizol總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO東洋紡生物工程有限公司；Icycler IQ熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HBZY-1用RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)液由10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素、10%FBS、RPMI-1640培養(yǎng)液組成。當(dāng)生長至90%貼壁時(shí)，用0.05% EDTA+0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105/ml 細(xì)胞密度接種于96孔板，4～6代后細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，加入30 mmol/L的高糖濃度和不同濃度(1，10，50，100 IU/ml)的rHuEPO，在不同時(shí)間進(jìn)行各種指標(biāo)檢測。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 取4～6代培養(yǎng)系膜細(xì)胞，加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使之轉(zhuǎn)入G0期，然后按培養(yǎng)液中含葡萄糖、rHuEPO濃度不同分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)分組：(1)正常對照組(NG)：葡萄糖濃度為5 mmol/L+2.5% FBS 的RPMI-1640；(2)HG組: 葡萄糖濃度為30 mmol/L；(3)E1:HG(30 mmol/L)+ rHuEPO (1U/ml)；(4)E2 :HG(30 mmol/L)+ rHuEPO (10 U/ml)；(5)E3:HG(30 mmol/L)+ rHuEPO (50 U/ml)；(6)E4: HG(30 mmol/L)+ rHuEPO (100 U/ml)，各組其它成分與對照組相同。

1.2.3Cell Counting Kit-8 (CCK-8)比色法檢測細(xì)胞增生 將1×105/ml細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，細(xì)胞生長至70%～80%融合狀態(tài)時(shí)換無血清培養(yǎng)基，孵育16 h使細(xì)胞同步化，然后分別加入不同濃度的葡萄糖和刺激藥物rHuEPO分別作用24，48，72 h，對照組加入等體積含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按CCK-8試劑盒檢測MC增殖。在收集細(xì)胞前4 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。于酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度(OD)值。每一組結(jié)果均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.4ELISA法測定細(xì)胞上清液MCP-1的水平，realtime PCR測定細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá) 應(yīng)用Icycler IQ熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)檢測：大鼠MCP-1 mRNA按照Trizol法提取總RNA(RNAsimple總RNA提取試劑盒)，按照TOYOBO Rever Tra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。MCP-1和GAPDH的引物序列和擴(kuò)增長度見表1。

表1 MCP-1和GAPDH的引物序列和擴(kuò)增長度

2 結(jié) 果

2.1不同濃度rHuEPO對MCs增殖的影響 rHuEPO各濃度組與高糖組比較，隨著rHuEPO濃度的增高及作用時(shí)間的延長，rHuEPO對MCs增生均有不同程度的促進(jìn)作用，這種差異隨著rHuEPO的濃度增大刺激增殖作用越強(qiáng)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

圖1 不同濃度的rHuEPO對MCs增殖的影響(OD值)

2.2ELISA測定上清液MCP-1的含量 正常培養(yǎng)的系膜細(xì)胞分泌少量的MCP-1，高糖組刺激24，48，72小時(shí)均有高水平的表達(dá)，與對照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rHuEPO濃度在1，10，50，100 IU/ml時(shí)，作用于高糖培養(yǎng)的MCs，細(xì)胞MCP-1的分泌與高糖組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著時(shí)間的延長，不同濃度的rHuEPO的作用逐漸增強(qiáng)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在不同的時(shí)間點(diǎn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液MCP-1含量的變化

注：aP<0.05 vs NC;bP<0.05 vs HG;cP<0.05 vs E1;dP<0.05 vs E2;eP<0.05 vs E3。

2.3細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)

目的基因的相對表達(dá)量采用△△CT法(指不同組別間CT值的差值)分析，以正常組作為對照樣本。△△CT=觀察樣品△CT-對照樣品△CT=(觀察樣本目的基因CT-觀察樣本內(nèi)參CT)-(對照樣本目的基因CT-對照樣本內(nèi)參CT)。樣本的相對表達(dá)量=2-△△CT。

正常培養(yǎng)的系膜細(xì)胞MCP-1 mRNA有低水平的表達(dá)，高糖組刺激24，48，72 h均有高水平的表達(dá)，與對照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。rHuEPO濃度在1，10，50，100 IU/ml時(shí)，作用于高糖培養(yǎng)的MCs，細(xì)胞MCP-1、TGF-β1mRNA的表達(dá)與高糖組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 各組大鼠系膜細(xì)胞(MCs)MCP-1 mRNA的相對表達(dá)量

注：**P<0.01 vs NC;##P<0.01 vs HG。

3 討 論

近年的研究發(fā)現(xiàn)EPO除了刺激紅細(xì)胞生成的作用外，有越來越多的證據(jù)支持EPO對非造血細(xì)胞有重要的生理作用。以往研究一直認(rèn)為EPOR僅存在于紅系前體細(xì)胞。已有研究表明在大鼠的離體心肌中、神經(jīng)系統(tǒng)的海馬及大腦皮層中的神經(jīng)元和神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞、肉芽組織局部的巨噬細(xì)胞表面有EPOR的表達(dá)[1-3]，另外，在腎臟、胃腸道、生殖道和紅骨髓、肝臟、腎臟均有表達(dá)，編碼EPOR mRNA已經(jīng)在心、腦、腎、骨骼肌及上皮細(xì)胞上被檢測出[4]。在腎臟，EPOR發(fā)現(xiàn)在腎小球系膜和管狀上皮細(xì)胞表達(dá)[5]，在皮質(zhì)、髓質(zhì)及乳頭部有表達(dá)，并在系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞和集合管細(xì)胞內(nèi)檢測出有表達(dá)[6]。EPO與EPOR相互作用誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，如促有絲分裂、抗氧化應(yīng)激、抑制凋亡以及通過動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管修復(fù)等。本研究觀察高糖環(huán)境下，rHuEPO對系膜細(xì)胞的增殖和分泌MCP-1的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rHuEPO能刺激高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞增殖，隨著作用時(shí)間的延長和濃度的增大，作用更明顯，rHuEPO濃度為10，50，100 IU/ml時(shí)刺激作用最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其具體作用的機(jī)制目前還不十分清楚。研究證實(shí)腎小球系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞表達(dá)EPOR，且腎臟細(xì)胞的EPOR核苷酸序列和紅系前體細(xì)胞的EPOR序列相同[6]。EPO促進(jìn)高糖系膜細(xì)胞的增殖作用可能通過激活EPOR介導(dǎo)，EPO與EPOR結(jié)合后激活一系列信號通路，包括JAK/STAT5，PI3K/Akt，NF-κB等途徑，從而發(fā)揮EPO的作用。目前研究[7-8]發(fā)現(xiàn)EPO可能的保護(hù)作用是通過降低細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，抗炎抗纖維化，免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)血管生成和修復(fù)等作用實(shí)現(xiàn)。

近年來，很多研究表明EPO可以抑制細(xì)胞炎癥因子的釋放以及炎癥細(xì)胞的浸潤。糖尿病腎病是常見和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一。在多種有害因素的刺激下，系膜細(xì)胞異常增殖釋放炎癥介質(zhì)，尤其是MCP-1等，腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)聚集，腎小球硬化。細(xì)胞外基質(zhì)的聚集與單核-巨噬細(xì)胞的廣泛浸潤有關(guān)。MCP-1是單核-巨噬細(xì)胞特異性的趨化因子，其介導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞在腎臟的聚集和活化對DN的發(fā)展起重要作用。高血糖可刺激腎小球系膜細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥因子MCP-1 mRNA表達(dá)和蛋白分泌增高。MCP-1屬于趨化因子家族，主要功能是趨化和激活單核/巨噬細(xì)胞。在糖尿病腎病的早期，腎小球即表達(dá)過量的MCP-1，可引起單核/巨噬細(xì)胞在腎組織浸潤，單核/巨噬細(xì)胞可以刺激腎臟細(xì)胞的活化和增生。而這些細(xì)胞的活化和增生可產(chǎn)生大量的炎性和致纖維化因子。一方面促進(jìn)了腎內(nèi)局部的炎癥損傷，另一方面，可使腎臟的ECM聚集，加速腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。有學(xué)者通過對膜性腎病患者腎組織免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性的蛋白尿與MCP-1的表達(dá)有關(guān)，抑制MCP-1表達(dá)可減輕DN的進(jìn)展[9]。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用ELISA方法和real time FQ-PCR顯示，高糖刺激大鼠系膜細(xì)胞24、48、72小時(shí)后，MCP-1蛋白分泌和mRNA的相對表達(dá)量較正常對照組顯著提高。關(guān)于具體的作用機(jī)制，有研究[10]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表達(dá)EPOR，更進(jìn)一步證實(shí)EPO有可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞趨化來抑制腎纖維化進(jìn)展。另有研究發(fā)現(xiàn)EPO通過Nuclear factor NF-κB (NF-κB)途徑抑制炎癥反應(yīng)，EPO與受體結(jié)合后，激活MAPKs和JAK2等胞內(nèi)途徑，對NF-κB和AP-1進(jìn)行調(diào)控，可明顯降低缺血再灌注損傷后的NF-κB和AP-1的活性，并降低循環(huán)TNF-α和IL-6的活性[11]。

綜上所述，rHuEPO對高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞有促增殖作用，但對高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞分泌MCP-1有顯著抑制作用，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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