泰安市外來婚嫁女HIV亞型分析

侯佩強 楊冬芳 張榮強 王娟娟 牟福生 楊會利

(泰安市疾病預防控制中心，山東 泰安 271000)

2006年以來，隨著泰安市外來婚嫁女等人群專題調查工作的深入開展，全市疫情呈現了較快增長的勢頭，從2004年報告首例外來婚嫁女感染者到2010年底，其感染人數已占全市疫情總數的15.75%，成為全市艾滋病感染率較高的人群之一，其中8名外來婚嫁女的丈夫感染了HIV，3例發生了母嬰垂直傳播，給感染者家庭和群眾健康造成了嚴重的危害，外來婚嫁女及其配偶子女感染已成為我市近年來艾滋病疫情快速增長的主要原因之一。根據本地的疫情狀況，我們采用RT-PCR的方法，測定了泰安市部分外來婚嫁女gag和env基因序列，比較本地區HIV在不同個體和亞型之間的基因變異性，探討其流行病學特點，為采取針對性的預防和控制措施提供依據。

1 材料和方法

1.1樣本來源 HIV抗體確認陽性，并能夠隨防到的泰安市外來婚嫁女HIV感染者/病人的抗凝全血或血清樣本。

1.2前病毒DNA提取

用淋巴細胞分離液分離樣品的單核細胞(PBMC)，PBS洗兩遍后，使用Qiagen公司的QIAamp Blood Mini Kit試劑盒提取單個核細胞中前病毒DNA，利用promega的逆轉錄試劑盒進行cDNA合成。

1.3套式聚合酶鏈反應(PCR)擴增

引物由大連寶生物公司合成。用多對引物進行HIV-1env基因和gag基因片段的擴增，其中，gag基因的引物為GAG-L：TCGACGCAGGACTCGGCTTGC，GAG-E2：TCCAACAGCCCTTTTTCCTAGG；GUX：AGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC，GDX：GGCTAGTTCCTCCTACTCCCTGACAT。Env基因的引物為ED5：ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTG，ED12：AGTGCTTCCTGCTGCTCCCA；Env7：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC，Env8：CACTTCTCCAATTGTCCCTCA。

Env基因擴增，第一輪反應條件：以ED5/ED12為外側擴增引物進行第1輪PCR反應，條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，1 個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保溫。以E7/E8為內側引物進行第2輪PCR擴增，條件為：94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，1個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保溫。

Gag基因擴增，第一輪反應為RT-PCR，反應條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，1個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫;第二輪PCR反應條件為： 94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，1 個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.4PCR產物的純化和回收

依據QIAquick Gel extraction kit 試劑盒進行，回收的樣品DNA應經電泳無明顯脫位、雜帶，取5 μl PCR回收產物經1%瓊脂糖100V電泳30 min，與標準分子量(Marker)比較，初步判斷樣品的濃度和質量。用2%瓊脂糖凝膠電泳濃縮后，切下特異擴增條帶進行純化、回收，再用1%凝膠電泳檢測其濃度和純度。

1.5DNA序列測定

將純化后的PCR 產物送南京金斯特公司進行測序，使用儀器為ABI 3730測序儀。

1.6序列分析

使用BioEdit軟件進行序列比對，然后使用MEGA 4.1軟件繪制系統進化樹。

2 結 果

2.1基因的亞型鑒定及系統進化樹分析

HIV-1分型主要依據env區基因序列并結合gag區基因序列，與HIV-1各個亞型國際參考株比較，通過系統進化分析，最后確定HIV-1病毒基因亞型[1]。T25，T26，T27，T29，T31樣本來源為泰安市外來婚嫁女。 gag區基因型分別為01AE(T26，T27，T29)，07BC(T25)和08BC(T31)；env區基因型分別為01AE(T26，T27，T29)，C(T25，T31)。因此5份泰安市外來婚嫁女樣本分屬于HIV-1型M組的三個亞型，其中3份CRF01-AE重組亞型(T26，T27，T29)，1份CRF07-BC(T25)和1份CRF08-BC(T31)。

圖1 泰安市HIV-1 gag基因系統進化樹

圖2 泰安市HIV-1 env基因系統進化樹

2.2基因離散率分析

見表1，各亞型env基因的組內基因距離及與國際參考株的基因距離均大于gag基因。

表1 不同基因區段不同亞型基因距離

3 討 論

HIV-1基因組主要由gag、env和pol這三個結構基因以及其他調控基因所構成，p24蛋白是由gag基因編碼產生的衣殼蛋白，是病毒的重要組成部分，同時其表面具有多個抗體結合位點，在免疫機制中也發揮重要作用，p24蛋白的編碼區高度保守，其表位序列的變化可能導致免疫逃避。env基因主要編碼產生包膜蛋白、跨膜蛋白等多種糖蛋白，序列變異性較大，其編碼的氨基酸差異可達30%，因此env基因的序列通常被作為確定亞型的重要依據[2]。pol基因主要編碼產生逆轉錄酶、蛋白酶等各種酶類，也是抗逆轉錄病毒藥物作用的主要靶位。

2001-2003年進行的第二次全國 HIV 分子流行病學調查，共發現 A、B(占2.55%)、B’(占29.11%)、C(占1.03%)、CRF-BC( CRF07- BC、CRF08- BC)、CRF01-AE(15.54%)和CRF02-AG8種類型HIV-1基因亞型，B’亞型還是分布最廣泛的 HIV-1亞型；CRF-BC(CRF07-BC和CRF08- BC)是我國HIV-1重組的主要模式,流行于全國大部分地區[3]; 通過對擴增成功的5樣品進行基因亞型鑒定, 發現外來婚嫁女感染者所攜帶的HIV-1毒株為CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC三個重組株，其中3例CRF01-AE重組亞型，1例CRF07-BC重組亞型和1例CRF08-BC重組亞型。泰國的研究顯示，CRF01-AE比泰國B亞型病毒更容易傳播，而且死亡時間比西方國家提前[4]。一項在中國南方四省(廣西、廣東、江西和湖南)的HIV分子流行病學調查顯示，CRF01-AE流行毒株在人群中所占比例較多，是優勢傳播毒株，并且和越南CRF01-AE有較高的同源性，存在與越南病毒株間的多次傳播[5]。通過對這五位外來婚嫁女的流行病調查，她們的來源也和分析相符。

Stoeckli認為，與env區8%～17%這樣較高的個體間變異率相比[6]，gag基因變異率稍低，在個體間的變異率為2.7%～5.9%。本研究結果與上述報道也一致。

影響特殊亞型和流行重組病毒的流行和傳播的因素仍然不清楚，新的亞型或重組病毒不斷在形成，并有可能成為新的流行病毒株，但是病毒變異和重組的特性是推動艾滋病變異的主要動力[7]。通過對外來婚嫁女HIV亞型分析，對我市HIV的來源將有更充分的認識，這有利于艾滋病的預防和控制，對防止二代感染也有積極的意義。

[1] 唐力，刑輝，等. 武漢市HIV-1相關基因序列分析及亞型分布[J]. 中國人獸共患病學報，2007,23(11)：1071.

[2] Cohen CJ, Hunt S, Sension M, et al. A randomized trial assessing the impact of phenotypic resistance testing on antiretroviral therapy[J]. Aids,2002,579-588.

[3] 劉翌．艾滋病病毒分子亞型流行病學研究進展[J]．中國國境衛生檢疫雜志，2006，( S1):146-150．

[4] Huang W,Eshliman SH,Toma J, er al.Coreceptor tiopism in human immunodeficiency virus type 1 subtype D ;high prevalence of CXCR4 tropism and heterogeeneous composition of viral population[J].J virol, 2007,81(15):7885-7893.

[5] Cheng CL,Fan Y,Wu SL, et al.Genetic characteristies of HIV-1CRF01-AE strains in four provinces, southern China[J].Zhonghua Liuxingbingxue Zazhi,2009,30(1):720-725.

[6] Stoeckli TC，MaWhinney S，Uy J，et al.Phenotypic and genotypic analysis of biologically cloned human immunodeficieney vuris type 1 isolates from Patients treated with zidovudine and lamivudine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002,46:4000-4003.

[7] 程華，鐘平.艾滋病病毒亞型及其影響[J]. 中國病毒學雜志，2011,1(2)：147-153.