松養心膠囊對兔心肌梗死后酪氨酸羥化酶mRNA表達及室性心律失常的影響

徐 紅

(泰山醫學院附屬泰山醫院心內科，山東 泰安 271000)

目前大量研究發現，心肌梗死后存在心臟交感神經再生、增生和不均一支配，交感神經重構與心肌組織重構、心肌電重構，共同成為心律失常和猝死的發生基質[1-5]。心肌梗死后再生神經以交感神經為主，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)在分子生物學實驗研究中，常被作為交感神經的標記物[6]，以探討心律失常的神經機制。

現代醫學認為心肌的氧化應激、炎性反應，細胞外基質的重塑和纖維化等共同參加了心律失常的發生過程，并成為抗心律失常藥物作用的新靶點。參松養心膠囊(SSYX)是一種復方制劑，具有多離子通道和非離子通道的抗心律失常作用[7,8]。隨機臨床驗顯示，SSYX對治療冠心病心律失常有明顯療效。但關于SSYX對MI后抗心律失常的機制和對心肌TH mRNA表達影響的相關研究鮮有報道。對此，我們進行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立和分組

45只新西蘭兔[普通級，編號SCXK(魯)20050015，2.5～3 kg]。購自山東中醫藥大學實驗動物中心。

MI模型制備：3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量行腹腔內注射麻醉、備皮。消毒后沿胸骨中線切開皮膚，暴露胸骨及肋軟骨。貼緊胸骨左緣剪斷第4～5肋骨，暴露縱隔及心臟，保持兩側胸膜完整，眼科鑷夾起心包膜，剪開心包，暴露出冠狀動脈。左心耳下緣至心尖部的中下1/3處用6/0線穿過心肌淺層縫扎前降支，進針深度約2.0 mm，記錄心電圖。心電圖示ST段抬高，且結扎水平以下心肌局部顏色變暗，搏動減弱，觀察20分鐘后逐層關閉胸腔。術后均給予青霉素肌肉注射3天，預防感染，單籠喂養，予以自主飲食(水)。

MI模型制備后，30只兔隨機分為心肌梗死組(MI組，n=15)和心肌梗死+參松養心膠囊組(SSYX組，n=15)。SSYX組自術后第1天給予參松養心膠囊藥粉 0.8 g/kg·d灌胃；MI組給予0.9%氯化鈉5 ml/kg·d灌胃；另取15只兔作為假手術組(Sham組)，冠狀動脈穿線但不結扎，同期普通飼料喂養8周。

1.2 電生理試驗

術后8周所有成模兔再次以3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內注射麻醉，心電監護，開胸，充分暴露心臟左室游離壁，縫制心包吊床。起搏電極由2支針形電極組成，電極直徑 0.3 mm，兩電極相距約3.0 mm，在梗死灶(梗死區蒼白邊緣2.0～3.0 mm)刺入2.0 mm。Sham組起搏電極放置在心臟的相應部位。

1.2.1梗死灶周(ERP)的測定

應用心臟電生理刺激儀(DF-5A型，蘇州市東方電子儀器廠)以S1S2 160 ms逆掃，每次遞減5 ms，測定梗死灶周心肌有效不應期(ERP)。

1.2.2程序電刺激誘發室性心律失常

在梗死灶周S1S2S3刺激和S1S1刺激8 min；未達刺激終點停止5分鐘后再重復一次上述電刺激直至誘發出室性心動過速(VT)、室顫(Vf)，如未誘發出VT/Vf，則在ERP基礎上增加 30 ms，加發S3刺激，直至誘發出VT/Vf。

1.3 總RNA的提取

應用Trizol(Invitrogen，美國)分別提取梗死灶周和非梗死左室游離壁心肌總RNA。100 mg組織塊加入1 ml Trizol 勻漿，冰上孵育后加入0.2 ml氯仿，震蕩，4 ℃離心(12,000轉/分)10 min，取上清液移入新管；加入0.5 ml異丙醇，4 ℃離心(12,000轉/分)5 min，棄去上清液；加入1 ml 75%乙醇洗滌，4 ℃離心(12,000轉/分)5分鐘，棄去上清液；DEPC處理水溶解RNA。紫光分光計測定260 nm、280 nm吸光度值(OD)，計算RNA總量。

1.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

應用RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)檢測mRNA的表達水平。1)合成cDNA：取2 μl 總RNA，加入10×逆轉錄緩沖液1μl 、dNTP 1 μl 、隨機引物0.5 μl 、RNA酶抑制劑0.25 μl 、AMV逆轉錄酶0.5 μl 、去RNA酶水配置總反應液體積為10 μl 。30 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min滅活逆轉錄酶。2)PCR反應：目的基因TH引物序列：上游5’AATTCGATTCCGACCTGGA 3’，下游5’RGATGTACTGGGTGCACTGGA3’，擴增目的片段398bp；以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參照物，GAPDH引物序列；上游5’GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT 3’,下游5’TGCCGAAGTGGTCGTGGATGCCT3’，擴增目的片段465bp。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。3)TH PCR反應體系：cDNA 10 μl 、5×PCR緩沖液 10 μl 、Tag酶0.25 μl ，目的基因及GAPDH上游、下游引物各0.5 μl ，加入雙蒸水至總體積50 μl ，94 ℃預變性5分鐘，擴增36個循環(條件：94 ℃變性30 s、57 ℃ 退火45 s、72 ℃延伸240 s、4 ℃5 min)。1.2%瓊脂糖電泳分析PCR產物，應用UVIpro凝膠圖像分析系統攝像并掃描分析，以目的基因與內參照物基因條帶吸光度比值作為目的基因的相對表達強度。

1.5 統計分析

2 結 果

2.1 動物一般情況

在制作 MI動物模型過程中，心電圖 I導聯和aVL導聯ST段上抬，部分動物 Ⅱ、Ⅲ和 aVF導聯出現 ST段上抬，冠狀動脈結扎線以下局部心肌搏動減弱，心肌顏色發紫。飼養過程中模型組、治療組及假手術組動物均無死亡。模型組及治療組二次開胸前心電圖 I、 aVL 導聯可見病理性Q波，假手術組心電圖前后變化不大。開胸后在冠狀動脈結扎附近梗死心肌呈現蒼白色，而假手術組冠狀動脈穿線附近心肌顏色無變化。經過 8 周的參松養心膠囊治療后，治療組心率較MI組有所下降(P<0.05，表1) 。

2.2 各組電生理參數

MI組較Sham組梗死灶周ERP明顯延長(120.6±7.3 ms 比91.4±5.8 ms，P<0.01)。經參松養心膠囊干預8周后，SSYX組有效不應期有所縮短至105.1±6.7 ms。在程序電刺激試驗中，MI組有2例(2/15，13.3%)誘發出VT，5例誘發出心室顫動(Vf)(5/15，33.3%)，室性心律失常(VA)總誘發率為46.7%。而SSYX組有1例(l/15，6.7%)誘發出VT，3例誘發出Vf(3/15，20.0%)，VA總誘發率為26.7%。VA總誘發率在SSYX組與MI組間有顯著性差異(表 1)。

表1 各組間電生理數據比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與MI組相比，#P<0.05

2.3 各組TH mRNA的表達水平

術后8周 MI組梗死灶周及非梗死左室游離壁TH mRNA的表達水平分別為(3.176±0.099, 2.028±0.072)，較Sham組相應部位(0.958±0.051 , 0.960±0.054 ，P<0.01)顯著增高。參松養心膠囊干預8周后，SSYX組相應部位TH mRNA的表達水平降低(1.768±0.113, 1.246±0.142)，與MI組比較有明顯統計學差異(P<0.01，表2)。

表2 心肌TH mRNA表達水平

注：與Sham組相比，*p<0.01；與MI組相比，#p<0.05

3 討 論

近年來大量研究證實MI時神經發生損傷變性，MI后慢性期存在神經鞘細胞和軸突再生及增生的動態演變過程，即神經重構。并且再生神經纖維大多數呈TH陽性，證實再生神經纖維以交感神經為主[9]。交感神經空間分布不均衡導致交感興奮時心臟電生理異質性增加可促使惡性心律失常的發生[10]。

程序電刺激是評價MI后室性心律失常發生的重要指標，實驗中我們通過程序電刺激檢測MI后心肌電生理參數發現，MI組梗死灶周ERP明顯延長，VA發生率增高。經參松養心膠囊干預后，SSYX組VA發生率降低。術后8周 MI組梗死灶周及非梗死左室游離壁TH mRNA的表達水平分較Sham組相應部位顯著增高(P<0.05)。參松養心膠囊干預后，SSYX組相應部位TH mRNA的表達水平降低，有明顯統計學差異。

MI后8周梗死灶周TH mRNA表達的增高說明梗死邊緣區域TH活性較高，NE合成增多，與VA發生率增高相關。TH位于腎上腺素能神經的胞漿中，是NE生成的限速酶。交感神經的過度增生，使局部組織NE增高，梗死灶周高濃度NE作用于心肌細胞腎上腺素能受體，使離子通道發生重構，包括: Ica,L密度增加，復極 K+電流減低等，導致區域間電生理異質性增加和心肌組織重構，觸發心律失常[1,3,11]。

現代藥理學研究提示SSYX顯著降低冠脈阻力和心肌耗氧量，對器質性心臟病和自主神經功能失調引起的室性早搏均具有顯著療效。SSYX作用于ICa，L、INa、Ito、IK多種離子通道，降低心肌細胞自律性，抑制折返激動，調節自主神經功能，多環節、多靶點抑制心律失常發生。李寧等[12]研究顯示SSYX對IK電流有抑制作用。IK有快速激活(IKr)和緩慢激活(IKs)兩種成分，心率增快時復極以IKs為主，SSYX阻滯心動過速時Iks，從而發揮抗心律失常作用。

總之，心肌梗死后心臟的交感神經重構增加了心肌對室性心律失常的易感性，參松養心膠囊干預可減低心肌梗死后的交感神經增生，從而降低室性心律失常的發生率。

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