環境因子對好氧不產氧光合細菌脂肪酸組成的影響

鄒麗潔, 焦念志

(廈門大學 環境科學研究中心 海洋環境科學國家重點實驗室, 福建 廈門361005)

環境因子對好氧不產氧光合細菌脂肪酸組成的影響

鄒麗潔, 焦念志

(廈門大學 環境科學研究中心 海洋環境科學國家重點實驗室, 福建 廈門361005)

對赤桿菌屬(Erythrobacter)、檸檬酸微菌屬(Citromicrobium)和玫瑰桿菌(Roseobacter)分支的 9株好氧不產氧光合細菌(AAPB)的脂肪酸組成進行分析, 并以10株非AAPB菌為參照, 從脂肪酸角度考察光照、溫度、營養等重要環境因子對AAPB的影響。結果顯示, AAPB的脂肪酸以C18：1w7c為主, 該成分在Roseobacter分支中含量最高, 不同種脂肪酸對環境因子的響應不同, 低溫和寡營養條件主要作用于不飽和脂肪酸(UFA); 二羥基脂肪酸在寡營養和光照雙重作用下有較明顯的升高。此外, 結合非AAPB的比較也為 AAPB脂肪酸研究提供了新的視角, 如溫度實驗顯示, 由于不飽和脂肪酸的比例較高, AAPB可能在寒冷海域有更好的競爭優勢, 而從饑餓培養試驗來看, AAPB的異養能力似乎比非AAPB更弱。

好氧不產氧光合細菌; 脂肪酸; 環境因子

好氧不產氧光合細菌(Aerobic Anoxygenic Phototrophic Bacteria, AAPB)在海洋中廣泛分布, 是能夠利用光能推動質子泵產生 ATP的異養細菌類群,這類細菌的光合作用能減少異養呼吸代謝過程中CO2的釋放, 增加保存于真光層的有機碳。到目前為止, 已報道的AAPB類群包括33個屬的52個種[1],隨著對這類細菌的分布和生態意義的深入研究[2-4],該類群的生理生態多樣性也被廣泛揭示：具有光合能力的“Citromicrobium”屬的AAPB被發現于沒有光照的深海熱液口[5], 該屬細菌JL354的基因組中存在兩套光合操縱子[6];Roseobacter分支的情況更為復雜, 它們占據多樣的生態位, 利用的有機物類型廣泛, 個體間異養能力差異很大[7-9]。盡管如此, 環境因子對這幾類 AAPB都有顯著的調控作用：寡營養條件能刺激細胞進行反饋調控, 誘導puf操縱子的表達以合成更多細菌葉綠素[10](Bacteriochlorophyll,BChl); 溫度可直接影響細胞內各種酶類的活性而影響細菌整個生理代謝過程, AAPB的生態分布與溫度的相關性得到了 Sargasso Sea和東海等生態調查的支持[11-12]; 光照主要影響細菌的光合能力, 對長赤細菌(Erythrobacterlongus)、玫瑰桿菌(Roseobacter denitrificans)等多株AAPB的培養實驗均證明瞬時光照可刺激細菌生長, 甚至光暗周期的比例也能影響細菌葉綠素的合成[13-16]。由此可見, 自然海區環境的復雜性使AAPB進化出多樣的適應機制。

生命過程是形成海洋碳庫的重要環節, 微食物環概念的提出更突出了微生物對海洋溶解有機質的分流改造作用, 因此不同環境條件下微生物生理指標的研究必不可少。脂肪酸作為細胞膜的重要組成成分對外界環境變化敏感, 常被用作評估微生物生存狀態的指標[17-18], 脂肪酸對溫度的響應主要有兩種形式, 一方面通過結構變化調整相變溫度, 維持細胞膜的流動性, 另一方面, 脂肪酸可以參與蛋白修飾調控, 如在光修復過程中脂肪酸能夠加速D1蛋白的合成[19]。已有的研究顯示本實驗涉及的 AAPB種屬含不飽和脂肪酸(Unsaturated fatty acids, UFAs)的比例較高[20], 楊等[21]還報道了一種特殊的脂肪酸并認為這可能是AAPB所特有的。然而到目前為止, AAPB這個功能類群的脂肪酸研究主要集中在菌株的脂肪酸組成及生物合成, 與環境因子相關的報道很少, 本文即以此為出發點, 結合非AAPB(非AAPB是指遺傳上與AAPB相近但缺乏puf基因而不具備光合能力的類群)一起探討AAPB的脂肪酸如何響應環境變化。

1 材料和方法

1.1 菌株信息及培養條件

菌株信息如表1所列。根據16S rDNA序列, 所選菌株分別屬于Erythrobacter,“Citromicrobium”和Roseobacter分支。

細菌在28℃的RO平板上黑暗培養。培養基為：酵母浸膏 1.0 g/L; 蛋白胨 1.0 g/L; 乙酸鈉 1.0 g/L;維生素(B12：20 μg/L; Biotin：2.05×10-9mol/L)、微量元素及15%瓊脂。細胞在接近平臺期收獲, 整個培養過程大約需要 4～5 d。除了正在考察的環境因素隨實驗設計變化外, 其他所有菌株均在上述標準化的培養條件下生長。

1.2 脂肪酸提取和分析

脂肪酸檢測采用 MIDI方法(Microbial Identification System 6.0), 收獲和提取步驟按照 Sherlock MIS公司提供的標準操作流程執行, 具體如下：

表1 實驗用菌株信息Tab. 1 Information of the studied strains

收獲：從四分劃線培養的平板上的第三分區上取約40 mg的菌體細胞放入潔凈培養管中;

皂化：每管加入 1.0 mL試劑 1(45g氫氧化鈉,150 mL甲醇, 150 mL蒸餾水), 蓋子密封, 振蕩后沸水浴30 min;

甲基化：培養管冷卻后加入2 mL試劑2(325 mL 6.0 mol/L鹽酸, 275 mL甲醇), 加蓋后短暫振搖, 80℃水浴10 min;

抽提：管子冷卻后加入1.25 mL試劑3(200 mL乙烷, 200 mL甲基-3-丁基醚), 封蓋后在醫用搖臺上輕輕翻轉10 min左右, 開蓋將管底的水相部分抽出拋棄;

堿洗：在有機相中加入3 mL試劑4(0.3 mol/L氫氧化鈉溶液), 翻轉5 min后取2/3有機相加入氣相色譜管中待測。

脂肪酸成分分析采用配備氫火焰離子化檢測器(FID)和 Ultra22色譜柱的 Agilent 6850氣象色譜儀,通過樣品出峰峰值及保留時間與標準樣品(MIDI,Inc.)的比較來確定脂肪酸的種類及相對含量, 借助MIDI公司提供的菌種庫信息可進行細菌種屬鑒定。

1.3 數據分析

脂肪酸組成的統計學分析采用 Past軟件(PAlaeontological STatistics, ver. 1.34), 16s rDNA序列經Clustal X(1.8)比對后用Mega3.1軟件進行NJ法聚類和建樹。脂肪酸聚類分析由MIS Sherlock軟件完成。Erythrobacter litoralisHTCC2594的基因組信息來自 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。

2 結果

2.1 細胞脂肪酸組成

本文對19株細菌進行了脂肪酸檢測, 結果顯示這些細菌共含有56種不同的脂肪酸成分, 鏈長從9碳到20碳不等, 大部分種類集中在14碳至18碳, 支鏈脂肪酸及二羥基脂肪酸也比較常見。表2列舉了部分主要脂肪酸的檢測結果, C14：0,C16：0及 C18：0等飽和偶碳鏈脂肪酸類型為絕大多數菌株共有。從脂肪酸比例上看,C18：1、C18：0、C16：0為所測菌株的主要脂肪酸, 其中 C18：1w7c含量較高, 在AAPB及非AAPB中分別占63.45% 和48.93%。檢測的19株菌中有18株含有C18：1w7c11-methyl,該成分也是α-變形菌中常見的種類[20]。此外, AAPB脂肪酸組成中還包括一些奇數脂肪酸如 C17：0, C17：1及少量環式脂肪酸如 C19：0cyclow8c。

表2 脂肪酸檢測主要結果Tab. 2 Main Results of Cellular Fatty Acid Compositions

從檢測結果來看脂肪酸組成與系統分類密切相關,Roseobacter分支的顯著特點是含有較多不飽和脂肪酸(均值為82.93%), 尤其是C18：1w7c的比例達到61.12%到88.33%, 這類物質被認為是α-變形菌綱的典型脂肪酸[22], 從檢測值看C18：1w7c在AAPB菌中的均值達到為77.2%, 高于非AAPB的64.17%(p=0.034), 而 C16：0則表現出相反的趨勢。Erythrobacter和“Citromicrobium”含羥基脂肪酸種類較多, 以 14碳至 16碳的二羥基飽和脂肪酸為主,這可能與這兩個屬含有鞘糖脂有關。二者在不飽和脂肪酸含量上并沒有顯著差異。

圖1比較了基于16s rDNA和基于脂肪酸組成所構建的系統進化樹, 從進化距離分析,Roseobacter分支的菌株在脂肪酸建樹上聚類較接近而在 16s rDNA樹上進化距離較遠,Erythrobacter的菌株則相反, 這種差異在JL1033和JL990的比較中更為明顯,雖然兩株菌的16s rDNA非常相似, 但脂肪酸組成差異顯著：JL990具有較多的支鏈脂肪酸, 而總不飽和脂肪酸比例比JL1033低30%。16s rDNA的聚類建立在基因水平上而脂肪酸建樹體現的是表達水平的聚類, 這兩者的差異是進化過程中不同的環境壓力和細菌適應性造成的, 因此我們建議在以16s rDNA為主要參考指標的系統進化研究中應當結合功能基因的分析, 才能得到更準確的推斷。

2.2 溫度、光照及營養的影響

溫度實驗用到三株非 AAPB和四株 AAPB菌,設置的溫度梯度為12℃ , 20℃, 28℃。結果顯示, 較低的溫度能夠增加 AAPB的不飽和脂肪酸的比例,降低 C16：0和 C18：0, 而支鏈脂肪酸、正反式脂肪酸等沒有顯著變化。圖2顯示的是12℃ , 20℃相對于28℃時細菌總不飽和脂肪酸的變化率。AAPB的變化幅度為2.5% 到12.7%, 平均5.8%, 其中發生主要變化的成分是 C18：1w7c; 非 AAPB 對低溫的響應方式與AAPB類似但不飽和脂肪酸的變化幅度較大, 為9.2% 到 47.3%, 均值 20.3%, 其中 C16：1是主要變化成分。此外大部分菌株的二羥基脂肪酸在低溫時比例下降, 這與Sphingomonassp.等的報道一致。

圖1 基于脂肪酸組成(左)和基于16s rDNA(右)構建的系統進化樹比較Fig. 1 Comparison of fatty acid-based (left) and 16S rDNA-based (right) neighbor-joining phylogenetic trees.

圖2 不同溫度下細菌總不飽和脂肪酸的相對變化率Fig. 2 Change rates of total unsaturated fatty acids (UFAs)at different temperatures

光照的響應主要是通過比較持續光照和持續黑暗兩種處理方式對細菌脂肪酸的影響來考察。然而實驗發現在 RO培養基充足的營養條件下兩種處理方式沒有顯著的差別。考慮到海洋細菌普遍長期處于營養限制環境中, 因此本文也觀測了 AAPB脂肪酸隨營養物質消耗的變化, 采用的菌株為 AAPB菌JL475和非AAPB菌 JL316, 實驗方案為：細菌在標準的RO液體培養基中預培養3d以耗盡培養基中的營養物質, 隨后取100 mL培養物與400 mL滅菌海水混合, 24 h后一半培養物進行光照處理, 另一半繼續黑暗培養。結果顯示, JL316的不飽和脂肪酸在整個培養過程中保持穩定而AAPB菌的UFA%逐漸下降, 該趨勢在20 h后更加明顯, 至培養結束時AAPB的 UFA%共減少了 28%, 其中變化最大的成分是十八碳不飽和脂肪酸(圖3)。光照的引入并沒有對脂肪酸整體組成產生顯著影響, 但值得關注的是羥基脂肪酸的變化, JL475光照培養體系(JL475L)的主要羥基脂肪酸C14：02OH的比例從開始的8.7%上升至13.1%最后回到9.2%(圖4), 在引入光照的18 h內有50%的增長, 而對照組JL475黑暗培養體系(JL475D)以及JL316的光(JL316L)、暗(JL316D)培養中都沒有觀察到這種現象。

圖3 隨營養消耗 18碳不飽和脂肪酸含量的時間序列曲線Fig. 3 Time serial contents of 18-carboned UFAs under nutrient deficiency.

圖4 光照和營養條件影響下C14：02OH比例隨時間的變化Fig. 4 Time series detection of both light and nutrient impacts on C14：02OH

3 討論

3.1 不飽和脂肪酸

對于海洋細菌而言, 低溫對脂肪酸的影響主要有提高不飽和度, 縮短鏈長, 增加支鏈脂肪酸或反式脂肪酸的比例等[23]。本研究中, 溫度的降低(28℃至12℃)提高了AAPB的UFA%同時伴隨飽和脂肪酸比例的下降, 這種適應機制在海洋細菌中非常普遍,在碳鏈中引入雙鍵降低了相變溫度, 因而在低溫下能夠保證細胞膜的流動性。低溫下JL316中C16：1增加的現象已在多株嗜寒細菌中發現[24], 該成分被認為是寒冷誘導的主要脂肪酸成分之一[25], 而 AAPB菌響應的成分主要是18碳的不飽和脂肪酸, 這可能與AAPB中C16：1的比例很低有關。

不飽和脂肪酸也參與細胞的營養調控[26], 脂肪酸的早期研究顯示饑餓狀態下細菌的磷脂含量會顯著下降, 給細胞膜流動性帶來顯著的影響[27]。本實驗中, 碳源不足可能是導致 AAPB脂肪酸合成終端的18碳不飽和脂肪酸比例下降的原因,Erythrobacter litoralisHTCC2594的基因組分析顯示該屬的細菌脂肪酸合成主要是從頭合成方式, 即通過脂肪酸合酶途徑不斷增加兩個碳單位的乙酰輔酶 A 合成 C16：0,C16：0作為18烷酰CoA去飽和酶的底物合成 C18：0及C18：1, 因此在碳源缺乏的情況下細菌傾向于維持C16：0而減少 C18：1的含量, 這與我們在 AAPB 中觀察到的現象一致。此外, 細胞的油酸和硬脂酸的比例是細胞膜流動性和信號傳導的指示[28,29], 因此 AAPB中較低的 C18：1/ C18：0比例可能也反過來限制了碳源利用。

本研究所涉及的 AAPB種屬普遍具有較高的不飽和脂肪酸, 尤其在Roseobacter分支中, 雖然Bchl.a與脂肪酸之間的聯系尚未發現, 然而研究普遍認為碳碳雙鍵是細胞氧化的敏感部位, 這似乎與 AAPB集中分布于氧化威脅較大的真光層相互矛盾[3,30]。由此, 考察了 AAPB的生理特性, 其中類胡蘿卜素的特殊性可能有助于解釋這個矛盾。類胡蘿卜的主要功能有兩方面, 一是作為輔助色素參與捕光, 二是起到抵御氧化脅迫的作用。目前的研究認為, AAPB普遍含有較多的類胡蘿卜素, 不論在總量上還是在類胡蘿卜素和細菌葉綠素的比值上[31,32,33], 大量極性類胡蘿卜素是均勻分布的, 即說明 AAPB的大部分類胡蘿卜素沒有參與能量傳遞[34], 因此,抗氧化的功能尤為凸顯, 雖然至今沒有實證, 但研究者普遍認為抗氧化機制是其主要功能之一[1], 因此類胡蘿卜素的保護作用可能是關鍵所在。

3.2 羥基脂肪酸

羥基脂肪酸是本研究中對環境變化較敏感的成分, JL475和JL316被認為具有類似的二羥基脂肪酸分布[21], 然而光照下二羥基脂肪酸在兩個功能類群中體現出不同的變化趨勢, 那么這類脂肪酸在AAPB發揮特殊生理功能時具有怎樣的作用呢？羥基脂肪酸主要通過飽和或不飽和脂肪酸的羥基化或者說分子修飾而來, 最近在 AAPB菌Erythrobacter.sp的研究中發現了特殊的酶氧化作用,該酶能作用于烯酸并產生相應的羥基脂肪酸, 巧合的是這個過程同樣受到光照和低溫的誘導, 與本研究的調控類似。盡管二羥基脂肪酸的合成機制未明, 脂肪酸的羥基化并不能直接拿來比較, 但這些過程為我們提供了可能聯系。本實驗中, 羥基脂肪酸的這種變化僅出現在AAPB中, 而這個類群區別于非 AAPB的最本質的特征是具有 Bchl.a, 因此,推測羥基脂質可能響應于光照刺激, 如果是這樣, 寡營養條件下 JL475的 C14：02OH在光誘導下的變化(圖4)就可以解釋了：在黑暗預培養階段 AAPB積累大量 Bchl.a, 光照刺激下, 細胞光合作用活躍, 二羥基組分積累, 而Bchl.a合成受持續光照的抑制, 因此, 18 h以后光合作用削弱并伴隨著羥基脂肪酸的下降。非 AAPB菌JL316因為不含細菌葉綠素而沒有這種波動現象, 這暗示了羥基脂肪酸可能參與Erythrobacter屬的AAPB光合調控。

3.3 從脂肪酸對環境的響應看 AAPB的生理生態特征

研究顯示,細胞膜流動性的改變可能作為初級信號啟動去飽和酶基因的表達[24,35], 但也有學者指出去飽和酶基因對溫度的變化并不敏感, 如負責引入第一個雙鍵的desC基因[36,37], 但改變細胞膜流動性依然是海洋微生物應對低溫脅迫的主要方式之一。本研究所有菌株中都觀察到了不飽和脂肪酸比例隨溫度的降低而增加, 但 AAPB菌的 UFA%變化率比非 AAPB小, 這個現象得到膜電位研究的支持[38],報道顯示,在不同溫度條件下AAPB的膜電位保持相對較高且較穩定的狀態。膜電位高說明細胞膜的通透性較低, 相應的流動性變化較小即與本實驗中脂肪酸不飽和度的變化小相對應, 這種狀態下 AAPB的細胞狀態優于非 AAPB, 說明穩定性利于細胞生存, 由此,推測 AAPB在低溫海域將得益于脂肪酸的穩定性而獲得生存優勢。這個推測也得到了野外試驗的證明, 如Cottrell等[39]報道的AAPB在冬天比夏天更具有相對與普通異養細菌的競爭優勢。

AAPB的特殊光合能力被認為有利于該類群在寡營養海域的分布, 本研究發現, 富營養條件下AAPB的脂肪酸主要成分幾乎未受光照影響, 而饑餓和光照同時作用時, 十八碳單不飽和脂肪酸的比例明顯降低, 主要表現出饑餓脅迫的效應, 因此,從脂肪酸變化情況來看, 雖然 AAPB能夠利用光能,但它們首先是異養細菌, 首要受營養條件的影響,光照不會對細胞膜結構造成顯著影響。此外,與非AAPB的對照發現, JL316的主要脂肪酸在整個營養試驗過程中均沒有顯著的變化, 可能源于該類群較好的異養能力, 這也可能是AAPB在缺少DOC的大洋環境中比例較低的原因之一。

AAPB作為重要的海洋功能類群, 還有許多特征有待發現和深入了解, 本文初步探討了脂肪酸方面的研究, 并結合 AAPB的生理生態特征指出些許功能類群相關的特性, 同時也為 AAPB研究提供了新的視角。

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Impact of environmental factors on fatty acid patterns of aerobic anoxygenic phototrophic bacteria

ZOU Li-jie, JIAO Nian-zhi
(State Key Laboratory of Marine Environmental Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Jun.,6,2011

Aerobic Anoxygenic Phototrophic bacteria; Fatty acid; Environmental factors

Fatty acid regulation is a crucial acclimation process which seems neglected by investigators of Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAPB). In the present study, cellular fatty acid compositions of 9 AAPB strains phylogenetically related to generaErythrobacter,“Citromicrobium” andRoseobacterclade were analyzed, along with 10 non-AAPB strains for comparison. The dominant fatty acid component in tested strains was C18：1w7c, which has the highest content inRoseobacterclade. Fatty acid compositions respond differently to environmental factors.Low temperature and oligotrophic conditions mainly affect unsaturated fatty acids (UFAs). An increase of 2-OH fatty acids was detected when nutrient and light act as the joint pressure for AAPB. In addition, taking non-AAPB strains into consideration provided a new perspective in AAPB research and some explanations related to ecological phenomenon were suggested. For example, AAPB may have advantages in cold marine areas owing to the high percentage of UFAs and the heterotrophic ability of AAPB was comparatively weaker than non-AAPB strains.

Q938 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)09-0009-08

2011-06-06;

2011-12-19

國家973計劃項目(2011CB808800); 國家海洋局項目(201105021); 國家基金委項目(41191021)

鄒麗潔(1984-), 女, 浙江嘉興人, 碩士研究生, 主要從事海洋微生物生態學研究, E-mail：2008354@163.com; 焦念志, 通信作者,電話：0592-2187869, E-mail：jiao@xmu.edu.cn

康亦兼)