蛋鴨HSP60基因cDNA克隆與序列分析

王德前，田 勇，李進軍，沈軍達，陶爭榮，李國勤，盧立志

(浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

熱休克蛋白 (heat shock proteins，HSP)具有高度保守性［1］，廣泛存在于微生物、植物、動物和人等生物機體內。當機體受到環境脅迫或有害刺激后會誘導熱休克蛋白的表達［2］。熱休克蛋白在應激狀態下通過保護線粒體中呼吸鏈的完整性和抑制凋亡通路，提高細胞的耐受力，直接或間接地保護細胞，并幫助變性或不可溶的凝聚蛋白恢復天然構象;另外熱休克蛋白還可作為分子伴侶和多肽鏈非特異性結合，催化介導蛋白質特定構象的形成，參與體內蛋白質的折疊、裝配和轉運。HSP60除了具有 HSPs共同特征外，研究還表明正體結構HSP60還可作為一個危險預警信號作用于天然免疫系統，通過激活單核白細胞、巨噬細胞、樹狀細胞等多種免疫細胞，并誘導產生一系列細胞因子，參與免疫反應［3-5］。總之，HSP60對維持細胞內穩態，改善細胞生存能力和減輕有害刺激損傷有著非常重要作用。

浙江省是蛋鴨飼養大省，年存欄2 000萬只以上，養殖規模與水平均居全國領先位置。蛋鴨舒適的飼養環境溫度一般為21～26℃;高于32℃高度應激。浙江省夏季的氣候特征為長時間的高溫、高濕，全年32℃以上的高溫天數平均在35 d以上，在蛋鴨飼養密集的麗水、金華等地超過50 d。浙江省夏季氣候容易導致蛋鴨熱應激綜合癥的發生，引起蛋鴨生理紊亂，降低采食量，造成生產性能、產品質量下降，不利于蛋鴨生產。因此，研究HSP60對于誘導蛋鴨內部的抗逆機制，增強其自身抵御環境突變能力，預防與控制熱應激發生具有重要的現實意義。

畜禽HSP60方面研究很少，GenBank中收錄的序列僅有紅色原雞、火雞、珍珠雞、豬、馬、牛、狼、猴子、鱷魚共9種動物［6-7］，蛋鴨HSP60研究還鮮見報道。為此，通過RT-PCR(反轉錄多聚酶鏈式反應)和RACE(末端快速擴增)技術擴增其蛋鴨HSP60基因編碼區，最后拼接而獲得全長核苷酸序列，并進一步分析其推導的氨基酸序列，為深入研究Hsp60基因的熱應激防控機理以及在生產實際中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物材料、菌株與質粒

試驗蛋鴨肝臟樣品來自諸暨國偉禽業有限公司紹興鴨原種場，采樣后迅速液氮冷凍保存備用。大腸桿菌JM109菌株由該實驗室保存。克隆載體pMD18-T購自大連寶生物公司。

1.1.2 酶與試劑

Taq聚 合 酶、TaKaRa EX Taq HS、dNTP、T4DNA連接酶、RT-PCR試劑盒、PCR產物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA Marker DL2000、Agarose Regular購自大連寶生物公司;GeneRacer試劑盒、總 RNA提取試劑盒 Trizol購自美國Invitrogen公司;氨芐青霉素、焦碳酸二乙酯(DEPC)購自北京天根公司;Tryptone、Yeast Extract購自Oxioid公司。其他常規生化試劑為國產分析純。引物由上海生工公司合成，測序由Invitrogen公司 (上海)完成。

1.2 方法

1.2.1 蛋鴨肝臟總RNA提取

樣品用液氮研磨成粉末，稱取粉末約200 mg，采用Invitrogen公司 TRIZOL試劑盒提取總 RNA。用紫外分光光度計測定RNA含量 A260∶A280，并立即使用或于-80℃冰箱保存。提取的總RNA采用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2 蛋鴨HSP60中間片段的克隆

根據GenBank已經報道的人、大鼠、小鼠HSP60 mRNA序列同源性比對分析結果，根據HSP60物種之間的氨基酸序列保守型設計簡并性引物 HSP60F1∶5＇ATHGARGGNATGAAGTTYGA3＇、HS P60R1∶5＇GCRTTYTTNGCDATNGTCA3＇、HSP60R2∶5＇C TTYTCRTTNACYTCNACRTC3＇。

第1輪PCR反應:引物HSP60F1、HSP60R1;反應 體 系 為 25 μL:cDNA0.5 μL，HSP60F1(10 μmol·L-1)1.0 μL，HSP60R1(10 μmol·L-1)1.0 μL， Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22.5μL;反應條件:94℃ 2 min;35 cycles∶94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、68 ℃ 1.5 min。

第2輪PCR反應:引物HSP60F1、HSP60R2;反應體系為25μL:第1輪反應產物，HSP60F1(10 μmol·L-1)1.0 μL，HSP60R2(10 μmol·L-1)1.0 μL， Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22.5μL;反應條件同第1輪PCR反應。

1.2.3 蛋鴨HSP60 5＇RACE片段的克隆

5＇RACE模板采用 GeneRacer Kit(Invitrogen)進行合成，利用獲得的蛋鴨HSP60中間序列，設計5＇RACE引物序列。

第 1輪 PCR反應:引物 5＇GeneRacer inner primer、r HSP60-R1∶5＇GTTGTCACC AAAACCTGGCGCT TTGAC3＇;反應體系為25μL:5＇RACE模板0.5μL，5＇GeneRacer outer primer(10 μmol· L-1)1.0 μL，rHSP60-R1(10 μmol· L-1)1.0 μL，Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22.5μL;Touchdown PCR 反應條件:94 ℃ 2 min，5 cycles∶94 ℃ 30 s、72℃ 1.5 min;5 cycles∶94℃ 30 s，70℃ 1.5 min;25cycles∶94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、68 ℃ 1.5 min。

第2輪 PCR反應:引物 5＇GeneRacer inner primer、 r HSP60-R3 ∶ 5＇CCAAAGGCTTGCGGTG ACTATTGGCA3＇;反應體系為25μL:第1輪 PCR產物0.5μL，其他同第1輪;反應條件:94℃2 min，30 cycles∶94℃ 30 s、62℃ 30 s、68℃ 1.5 min。

1.2.4 蛋鴨HSP60 3＇RACE片段的克隆

3＇RACE模板采用 GeneRacer Kit(Invitrogen)進行合成，利用獲得的鴨HSP60中間序列，設計3＇RACE引物序列。第 1輪 PCR反應引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F2∶5＇TCAGCCCC ATGACTTTGGTAAAGTTGG3＇，第2輪 PCR反應引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F3∶5＇CTGAT GGCGTAGCAGTATTAAA GGTTGG3＇;反應體系與反應條件同5＇RACE。

1.2.5 TA克隆與序列分析

采用pMD18-T載體進行TA克隆，將用膠回收試劑盒回收的 PCR產物，與 p MD18-T載體、T4DNA連接酶混合。10μL反應體系的組成為:pMD18-T Vector DNA 1 μL，Insert DNA 4 μL ，Solution I 5μL。16℃連接過夜，并轉化大腸桿菌JM109的感受態細胞，在含 X-Gal、IPTG、Amp的LB培養基上，37℃培養過夜直至長出白色菌落。得到的陽性克隆經PCR驗證后，將陽性菌穿刺培養后送上海英俊公司測序。DNA測序采用ABI公司的3730型全自動DNA測序儀。對測序結果采用MegAlign軟件進行cDNA序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 蛋鴨肝臟總RNA提取

由圖1可知，提取的肝臟總RNA28S和18S的帶型較好，亮度比接近2∶1，A260/A280=2.04，說明RNA完整性很好，在提取過程中沒有降解，純度高，可以用于RT-PCR擴增。

圖1 蛋鴨肝臟的總RNA

2.2 蛋鴨HSP60中間片段兼并引物擴增

HSP60F1、HSP60R1作為第1輪反應引物反轉錄合成第1鏈cDNA后，以反轉錄產物為模板，采用兼并引物 HSP60F1、HSP60R2進行 PCR擴增，擴增出1條約650 bp的條帶 (圖2)，經TA克隆測序分析后發現，該片段正是目的基因片段。

圖2 蛋鴨HSP60的中間片段 (650 bp)

2.3 蛋鴨HSP60 5'RACE克隆分析

在獲得1段已知HSP60基因中間片段的基礎上，設計第1輪反轉錄引物5 GeneRacer inner primer、r HSP60-R1、第2輪反轉錄引物 GeneRacer inner primer、r HSP60-R3，擴增 HSP60基因片段 5＇端序列，得到1條約1 100 bp的目的基因片段 (圖3)。

圖3 蛋鴨HSP60的5＇RACE片段 (1 100 bp)

2.4 蛋鴨HSP60 3'RACE克隆分析

利用獲得的鴨HSP60中間序列，設計3＇RACE第 1輪反 轉錄引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F2，第1輪反轉錄引物 3＇GeneRacer outer primer、r HSP60-F3;擴增出了1條約1 100 bp的目標基因條帶，經TA克隆并測序驗證后，上述片段為蛋鴨HSP60目標基因片段 (圖4)。

圖4 蛋鴨HSP60的3＇RACE片段 (1 100 bp)

2.5 蛋鴨HSP60基因序列分析

MegAlign比對分析顯示，蛋鴨該基因與紅色原雞、火雞、珍珠雞等物種很高的序列同源性，相似系數分別為 93.1%，92.6%，90.9%(圖 5-6)，進一步證明克隆的基因就是蛋鴨HSP60基因。5＇端片段和 3＇端片段拼接后，獲得 1條 2 027 bp HSP60基因mRNA序列，該序列3＇末端完整，距5＇端起始密碼子 ATG 58 bp，其中 ORF序列長度為 1 707 bp(圖 7-8)。

圖5 HSP60基因ORF核苷酸序列相似性分析

圖6 HSP60基因ORF序列進化樹分析

3 小結與討論

通過GenBank中其他物種HSP60基因序列同源性比對，設計相應的兼并引物，應用RT-PCR手段成功克隆了1段約650 bp蛋鴨HSP60基因片段。在獲得已知序列的蛋鴨HSP60基因片段的基礎上，設計相應引物，采用RACE的技術手段，獲得了蛋鴨 HSP60基因 5＇、3＇端全長序列，長度都約為1 100 bp。序列拼接后獲得 1條 2 027 bp蛋鴨HSP60基因 mRNA序列，其中 ORF序列長度為1 707 bp。

蛋鴨HSP60基因ORF序列與紅色原雞、火雞、珍珠雞等家禽具有很高的同源性，相似系數都在90%以上;豬、牛、馬HSP60基因之間同源性也很高，均在94%以上;相近的物種具有更高的基因序列相似度，佐證了HSP60家族在進化上具有高度保守性［8-9］。

圖7 蛋鴨HSP60基因ORF序列同源性比對分析 (1～900 bp)

圖8 蛋鴨HSP60基因ORF序列同源性比對分析 (901～1 720 bp)

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