上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的表達狀況及臨床價值

劉云春 舒麗莎 于秀梅

卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤，由于腫瘤的發生發展與細胞的凋亡、抑癌基因的失活關系密切，FHIT和Bax基因在促進細胞凋亡中發揮重要作用。本研究通過檢測卵巢腫瘤組織中FHIT和Bax蛋白的表達狀況，分析它們與上皮性卵巢癌臨床分期、病理類型、病理組織分級、淋巴轉移等臨床病理諸特征的關系，探討其在腫瘤發生發展中的作用和關系，了解其在卵巢癌預后方面的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北北方學院附屬第一醫院婦產科住院并經手術治療的原發性的上皮性卵巢癌患者材料，選擇病歷資料完整者共50例，患者年齡21～76歲，平均年齡(54±12)歲，經手術病理檢查確診，其中病理類型:卵巢漿液性癌30例，粘液性癌14例，子宮內膜樣癌4例，透明細胞癌2例;病理分化程度:高分化 32例，中低分化 18例;手術病理分期［按國際婦產科聯盟(FIGO)2000年手術病理分期標準］:Ⅰ期和Ⅱ期16例，Ⅲ期和Ⅳ期34例;盆腔淋巴結有轉移者16例，無轉移者34例。選擇同期卵巢良性卵巢腫瘤20例及卵巢交界性腫瘤15例作為參照。

1.2 免疫組化分析 采用免疫組織化學SP法，一抗為兔抗人FHIT蛋白多克隆抗體，鼠抗人Bax多克隆抗體，稀釋1∶50為工作濃度。SP試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)為北京中山生物技術公司產品。手術標本均經10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，3 μm厚連續切片，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。切片染色前常規脫蠟、水化，修復抗原，0.3%H2O2溶液阻斷內源性的過氧化物酶，全部操作過程按SP試劑盒說明書操作規程完成。用已知的陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽(PBS)緩沖液代替一抗作為陰性參照。

1.3 染色特征及結果判定標準 FHIT和Bax的染色定位于腫瘤細胞漿中，以細胞漿中出現棕黃色顆粒視為陽性細胞，參照Connlly等的方法，染色結果判定的標準是根據染色的強度和陽性細胞百分數綜合評分:(1)染色強度:無著色是0分;淡黃色是1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分;(2)陽性細胞百分數:＜10%為0分;10% ～50%為1分;50% ～75%為2分;＞75%為3分。FHIT和Bax最終的評定結果為染色強度和陽性細胞百分數的乘積，1～2分為陰性，3～9分為陽性。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗和確切概率法(Fisher’s exact test)，FHIT和Bax蛋白的相關性采用Speaman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FHIT和Bax在卵巢上皮性腫瘤中的表達 FHIT蛋白在良性組和交界性組中均陽性表達，癌癥組中的陽性率降低為72%，明顯低于良性組和交界性組(χ2=11.732，P ＜0.05);Bax主要表達在卵巢上皮(或癌細胞)的胞漿，間質偶有表達。3組Bax的表達依次增加，但差異無統計學意義(χ2=5.066，P＞0.05)。見表1。

表1 不同組織中FHIT和Bax的表達 例

2.2 病理分期與FHIT和Bax的表達 卵巢癌組病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期FHIT陽性表達率分別為75%和70.58%，2組比較差異無統計學意義(P＞0.05);卵巢癌組病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期Bax陽性表達率分別為43.75%和38.23%，2組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 病理分期與FHIT和Bax的表達 例

2.3 病理類型與FHIT和Bax的表達 3組FHIT、Bax陽性表達率接近，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

2.4 分化程度與FHIT和Bax的表達 在高分化、中低分化卵巢癌組織中FHIT陽性表達率分別為81.25%和55.55%，2組比較差異有統計學意義(P＜0.05)在高分化、中低分化卵巢癌組織中Bax陽性表達率分別為50.00%和22.22%，2組比較差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表4。

表3 病理類型與FHIT和Bax的表達 例

表4 分化程度與FHIT和Bax的表達 例

2.5 淋巴結轉移與FHIT和Bax的表達 在淋巴結有轉移組和無轉移組的卵巢癌組織中FHIT陽性表達率分別為82.35%和50%，2組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。在淋巴結有轉移組和無轉移組的卵巢癌組織中Bax陽性表達率分別為38.23%和43.75%，2組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表5。

表5 淋巴結轉移與FHIT和Bax的表達 例

2.6 卵巢癌組織中FHIT和Bax表達的相關性 50例卵巢癌組織中FHIT和Bax表達的關系，進行spearman相關分析顯示，FHIT和Bax表達呈正相關(r=0.400，P ＜0.01)。見表6。

表6 卵巢癌組織中FHIT和Bax相關性 例

3 討論

3.1 FHIT的表達與上皮性卵巢癌的關系 Buttitta等［1］對54例早期卵巢癌研究發現，4%(2/54)FHIT基因出現異常轉錄，15%(8/54)有等位基因的缺失，22%(12/54)有乳腺癌和(或)卵巢癌家族史的年輕患者，這些病例無FHIT基因的改變。結果表明，FHIT在卵巢癌的發生中起一定的作用。另一項卵巢癌研究發現，晚期癌中位于染色體3p14的FHIT位點的LOH頻率顯著增高，提示FHIT與晚期卵巢癌有關。Manderson等［2］報道一些上皮性卵巢癌標本中3號染色體短臂(3p)有三個最小區域的缺失，提示FHIT基因的失活可能對卵巢癌的發生有重要作用。Mandai等［3］研究發現39%的卵巢癌和83%的交界性卵巢腫瘤標本同時出現正常和異常的FHIT轉錄，8%(4/51)的卵巢癌標本其FHIT轉錄缺失且均為Ⅲ～Ⅳ期的低分化晚期卵巢癌病例，而在良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中FHIT轉錄未見異常。Ozaki等［4］用免疫組化分析了44例卵巢癌、19例交界性癌和16例良性腺瘤的FHIT的表達:14%(6/44)的卵巢癌標本中FHIT蛋白表達降低或缺失，但在交界性和良性腫瘤中均蛋白表達;蛋白表達的缺失與FHIT基因轉錄缺失密切相關，也都發生在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)腺癌病例中。這些研究提示FHIT基因的轉錄和表達異常可能是卵巢惡性腫瘤，特別是晚期腫瘤的一個重要標志，FHIT表達缺失或降低是卵巢癌發生的重要遺傳學事件。

本試驗主要研究FHIT在上皮性卵巢癌中的表達情況，發現28%的卵巢癌FHIT蛋白表達降低或缺失，表達較良性卵巢上皮性腫瘤和交界性卵巢上皮性腫瘤明顯降低(P＜0.05);但在良性上皮腫瘤和交界性卵巢上皮性腫瘤中的表達無明顯的差異(P＞0.05)。本試驗進一步研究發現FHIT的表達與病理分級和淋巴結轉移關系密切(P＜0.05)，FHIT蛋白的低表達主要見于低分化癌和有淋巴結轉移者，提示FHIT與卵巢癌的惡性生物學行為密切相關，在卵巢癌的發生發展中起重要作用，其異常表達與卵巢癌的預后有關。

3.2 Bax的表達與上皮性卵巢癌的關系 Schuyer等［5］報道Bax表達與卵巢癌自然發展過程(相對危險系數0.44，P=0.05)和總生存率(相對危險系數 0.42，P=0.03)有聯系。Bax的表達可能成為卵巢癌患者的一個預測指標。Shigemasa等［6］用半定量PCR技術測定Bax在卵巢腫瘤及腺癌中表達明顯高于卵巢正常組織(P＜0.05)。生存分析表明Bax mRNA的低表達與卵巢癌Ⅲ期患者的低生存密切相關(P=0.05)。Kupryjanczyk等［7］研究表明，Bax表達與 PR水平相關(P ＜0.0189)，而與ER無關，說明Bax蛋白調節有一定的組織特異性。Bax可隨卵巢黃體周期而改變，在月經中期及妊娠早期無表達，而在退化黃體中有表達，提示Bax通過控制凋亡在人類黃體壽命中期重要作用。當妊娠后，hCG可通過降低Bax的表達來延長黃體壽命。Skirnisdottir等［8］報道，Bax的陽性表達與年齡相關(P=0.012)，提示更好的生存率。多變量回歸分析表明，腫瘤分級(P=0.0006)和 Bax的表達(P=0.020)是獨立和有意義的預后指標。

本實驗研究發現:從良性到惡性卵巢上皮性腫瘤Bax均有表達，但差異無統計學意義(P＞0.05)。卵巢上皮性癌中Bax的陽性表達只與組織分化程度有關，Bax的陽性表達率與年齡、FIGO分期、病理類型、殘余灶大小、淋巴結轉移不相關(P＞0.05)。譚毅等［9］也發現卵巢上皮性腫瘤中有 Bax的表達，但差異無統計學意義(P＞0.05);Bax在不同組織分化的卵巢癌中的表達有顯著差異，組織分化越好，Bax的表達率越高。而譚毅等［9］報道，Bax在卵巢癌中的表達與病理分級成正比，與我們的結果不同。以上檢測結果的不同，可能是受樣本例數、檢測對象和實驗方法的靈敏度等的影響，故可通過通過擴大樣本和改進方法等來進一步研究。

3.3 上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的相關性 在上皮性卵巢癌中FHIT和Bax的相關性鮮見報道。本試驗探討FHIT和Bax在皮性卵巢癌發生發展中的相互關系，發現FHIT和Bax的表達成正相關(r=0.400，P ＜0.01)。因為 FHIT、Bax 參與了細胞凋亡的調節。所以FHIT和Bax在卵巢腫瘤形成和發展中是相輔相成的關系。

卵巢上皮性腫瘤的發生需要多個癌蛋白的參與，這些癌蛋白可誘導瘤細胞的增生、分化、轉移及腫瘤血管的形成。FHIT可能通過參與凋亡的調節，抑制卵巢上皮腫瘤的形成及惡性進展。本試驗發現卵巢上皮性癌中的FHIT表達缺失高于卵巢良性或交界性腫瘤，而且卵巢上皮性癌中FHIT表達隨組織分化及淋巴結轉移差異有統計學意義(P＜0.05)。實驗還同時發現Bax也參與了卵巢上皮性腫瘤的發生發展。所以FHIT和Bax在卵巢上皮性腫瘤的發生發展中具有重要意義。

卵巢癌的化療是卵巢癌治療的重要手段，研究表明，許多化療藥物均能不同程度地誘導凋亡，腫瘤細胞凋亡敏感性可能是影響化療效果的關鍵因素［10］，因此，能否誘導凋亡已成為篩選抗癌藥物的標準之一，如何誘導凋亡也成為新的化療目標。

癌基因的異常表達或抑癌基因的表達缺失導致腫瘤對傳統治療方案敏感性下降，由此帶來腫瘤的進展和療效的下降。新的基因治療是通過基因傳遞恢復腫瘤細胞對傳統治療的反應性。因此，促凋亡基因家族成員Bax可以成為腫瘤細胞傳統化療和放射治療的增敏劑。有研究表明，當放療聯合Ad/Bax比單獨放療或Ad/Bax顯著增加了卵巢癌細胞的死亡，此外，與Bax調節細胞死亡相一致的是放療聯合Ad/Bax可明顯的觀察到卵巢癌細胞的凋亡［11］。

1 Buttitta F，Marchetti A，Radi O，et al.Evaluation of FHIT gene alterations in ovarian cancer.Br J Cancer，1998，77:1048-1054.

2 Manderson EN，Presneau N，Provencher D，et al.Comparative analysis of loss of heterozygosity of specific chromosome 3，13，17，and X loci and Tp53 mutations in human epithelial ovarian cancer.Mol Carcinog，2008，34:78-90.

3 Mandai M，Konishi I，Kuroda H，et al.Expression of abnormal ranscripts of the FHIT(fragile histidine triad)gene in ovarian carcinoma.Eur J Cancer，1998，34:745-749.

4 Ozaki K，Enomoto T，Yoshino K，et al.Impaire FHIT expression characterizes serous ovarian carcinoma.Br J Cancer，2001，85:247-254.

5 Schuyer M，Vander Burg MF，Henzen Logrnans SC，et al.Reduced expression of bax is associated with poor prognosis in patients with epithelial ovarian cancer:a multifactorial analysis of TP53，p21，Bax and Bcl-2.Br J Cancer，2001，85:1359-1367.

6 Shigenmasa K，Katoh O，Shiroyama Y，et al.Increased MCL-1 Expression is associated with poor prognosis in ovarian carcinomas.Jpn J Cancer Res，2002，93:249-253.

7 Kupryjanczyk J，Dansonka Mieszkowska A，Szymanska T，et al.Spontaneous apoptosis in ovarian carcinoma:a positive association with p53 gene mutation is dependent on growth fraction.Br J Cancer，2000，82:579-583.

8 Skirnisdottir I，Sorbe B，Seidal T，et al.P53，bcl-2，and bax:their relations hip and effect on prognosis in early stage epithelial ovarian carcinoma.Int J Gynecol Cancer，2001，11:147-158.

9 譚毅，張曉化，將友義.抗凋亡基因bcl-2和bax與卵巢上皮性腫瘤的關系.現代婦產科進展，1997，6:19-21.

10 Ckman JA.Apoptosis and chemotherapy resistance.Eur J Cancer，1996，32:921.

11 Arafat WO，Gomez-Navarro J，Xiang J，et al.An adenovirua encoding proapototic Bax induces apoptosis and enhances the radiation effect in human ovarian cancer.Molecular Therapy Res，2006，6:545-554.