心肌再生的種子細胞的研究進展

陳磊 鄧子軍 綜述 李玉泉 楊向群 審校

心肌再生的種子細胞的研究進展

陳磊 鄧子軍 綜述 李玉泉 楊向群 審校

以往認為心肌再生極為困難，近年來隨著種子細胞的研究深入，心肌再生已成為可能，細胞移植已成為心肌病損替代治療的新興方向。本文就心肌再生研究領域中用于移植的種子細胞的研究進展進行綜述。

心肌 再生醫學 種子細胞

急、慢性缺血都可導致心肌細胞壞死、凋亡，并形成瘢痕，最后導致心臟的電生理活動和泵血功能障礙。傳統觀點認為，心肌是終末細胞，缺乏再生能力，然而心臟干細胞的發現表明心肌是可以再生的。但是，由于心肌再生能力極弱，體內心臟干細胞的數量和再生速度遠不能滿足缺血后心功能恢復的需求。研究表明，基于細胞移植的再生醫學方法可使患者心肌得到再生。本文就心肌再生領域中用于移植的種子細胞的研究進展進行綜述。

1 骨骼肌成肌細胞

骨骼肌成肌細胞（Skeletal myoblasts,SM）是最早用于心肌修復的種子細胞[1]，由于來源廣泛、體外增殖能力強、在心梗條件下生存能力很強等優勢，SM的應用很快進入了臨床試驗階段。然而，它在體內并不能轉化為心肌細胞，與心肌細胞也不能形成縫隙連接[2]，導致細胞移植后存在同步化障礙和心律失常的隱患。Menasché等[3]報道，移植SM后，患者室性心律失常的發生率明顯升高，且未發現心功能改善。美國FDA已禁止將此作為心肌修復的治療手段。但Roell等[4]發現，通過使SM過表達縫隙連接蛋白43，可增強它與心肌的同步能力，預示著由SM移植造成的心律失常將有望得到預防。目前，SM常用于基因修飾的載體細胞，最近有研究將小鼠SM重編程為iPS，用于修復小鼠心肌梗死獲得成功[5]。

2 胚胎干細胞

人胚胎干細胞（Embryonic stem cells,ES）已經成功地被誘導為跳動的心肌細胞，通過使用粒細胞集落刺激因子[6]、維生素C、p38促分裂原活化蛋白激酶抑制劑[7]等，均能顯著提高它向心肌細胞的轉化率。此外，移植的心肌細胞不但可以長期存活并進一步分化成熟，還能與宿主心肌組織相融合，提高心肌損害動物模型的泵血功能[8]。但ES移植要走向臨床，還面臨著許多難以克服的缺陷。首先，它的應用存在倫理方面的問題；其次，對誘導后的心肌細胞進行分離純化和擴增仍然難以完善地解決，盡管已有研究者利用基因抗性、硅石膠態懸浮液梯度離心等方法進行篩選，但還沒有發現一種較為成熟和安全的方法適用于臨床；再次，分化不成熟或者向其他方向分化的ES在移植后的致瘤性問題目前仍無法解決。最近，用輻射過的ES細胞注入小鼠或恒河猴的心梗部位，使其心功能得到改善，心梗面積也顯著減小。該結果表明，ES不需要通過轉化為心肌細胞也能修復心肌梗死[9]。

3 誘導性多能干細胞

Takahashi等[10]利用逆轉錄病毒將4個轉錄因子c-Myc、Oct3/4、SOX2、Klf4導入人成纖維細胞，獲得了誘導性多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPS），并成功利用激活素A（Activin A）和骨形成蛋白 4（Bone morphogenetic protein-4，BMP4），在體外將它誘導為跳動的心肌細胞。隨后相關研究進一步證實了它向心肌分化的能力。Nelson等[11]報道，將iPS直接移植到心肌內，可以引起心肌細胞的原位再生，并可改善心梗后的心功能。Fujiwara等[12]運用環孢素A提高了iPS向心肌分化的效率。這些研究成果表明，iPS極有可能成為理想的心肌再生種子細胞。但是，由于誘導過程需要轉基因，可能存在腫瘤源性基因融合的危險。盡管有報道無需轉導c-Myc基因也可以獲得iPS，并可以培育出有穩定心肌分化特性的細胞[13]，但其致瘤性仍不能完全克服。因此，在臨床應用之前，相關的安全性研究和進一步的動物實驗是目前的研究重點。

4 心臟干細胞

1998年，Kajstura等[14]首先在心臟中發現了一類具有自我更新、表達心肌表面標志的細胞，并推斷心臟中存在心臟干細胞（Cardiac stem cells，CSC）；后續研究發現，心梗后 CSC可發生歸巢、分化[15]。這些結果改變了人們以往對心臟自我穩態維持及損傷修復的認識，同時也為心肌再生的研究提供了一條新的思路。一般認為，CSC主要表達Islet-1、Sca-1、ckit。以干（祖）細胞不同抗原為基礎，可將CSC分為c-kit+細胞、側群 （Side population，SP）細胞和成心肌細胞（Cardioblast）。

研究還證明，除了在體內能夠自我更新、橫向分化外，CSC在條件培養基中[16]以及和心肌細胞共培養的條件下也能分化為自主搏動的心肌樣細胞，造血生長因子和胰島素樣生長因子可以刺激其增殖[17]；其次，是c-kit基因啟動了CSC的分化[18]，在心梗發生時，通過激活p38-MAPK途徑可使CSC從正常心肌組織向梗死部位遷移[19]；再次，他汀類降脂藥能激活心臟原位的CSC增殖、分化[20]，從而能有效地減少心肌死亡。

盡管通過CSC增殖分化可使心肌再生，但在體內并不足以替代病損心肌的功能。因此，Lee等[21]成功地從心肌穿刺標本中分離擴增CSC，通過移植擴增的細胞來改善心功能。由此可見，CSC具有廣闊的臨床應用前景，目前已進行了Ⅰ期臨床試驗[22]，相關的基礎和臨床研究正在進行。隨著對CSC認識的深入，以細胞移植為基礎，結合心臟輔助技術的治療策略，有可能成為心肌再生領域中一個革命性的里程碑。

5 骨髓間充質干細胞

Nagaya等[23]將骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSC）移植到大鼠心梗區域后發現，移植的細胞分化為心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞，并分泌血管源性細胞生長因子，使得梗死面積縮小，心功能顯著改善。Gnecchi等[24]發現，在移植72 h內，細胞尚未完全分化為心肌時，即可觀察到心功能和移植部位的血供明顯改善，因此推測早期的心功能改善不能全部歸結于移植細胞的心肌再生作用，而應考慮是細胞移植的其他效應所致；DeSantiago等[25]證實,BMSC通過旁分泌作用抑制心肌細胞死亡，并加強其收縮力；此外，這些信號分子還可增強CSC在缺血缺氧條件下的應激能力，刺激其增殖、分化，并介導其向病損部位遷移[26]。

BMSC不表達MHCⅡ類分子，免疫原性低，可通過與T細胞密切接觸而抑制其功能[27]。因此，BMSC的同種異體移植并不需要應用免疫抑制劑。另外，Du等[28]發現，BMSC還具有免疫調節作用，通過抑制NF-kappaB通路，導致TNF-α和IL-6分泌減少、IL-10分泌增多，從而減輕炎癥反應對殘存心肌的損傷。

盡管上述研究成果說明BMSC適合作為心肌再生的種子細胞，但是臨床應用還存在著一些亟待解決的問題。首先，由于缺乏特異性表面標志，BMSC的鑒定將是今后研究的重點之一；其次，細胞誘導和分化機制有待進一步闡明，為臨床應用提供可靠的理論基礎；另外，細胞誘導及純化方法需要更深層次的探索，以使其具備臨床應用所必須的安全性和可靠性。

6 脂肪組織來源的種子細胞

6.1 脂肪干細胞

2003年，Rangappa等[29]用5-氮雜胞苷成功誘導白色脂肪的脂肪干細胞（Adipose-derived stem cell，ADSC）向心肌分化；次年，Planat-Benard等[30]首次證實了白色脂肪的ADSC可以自發地分化為心肌細胞，Gwak等[31]利用轉化生長因子β1也成功地將ADSC誘導為心肌。隨后，Choi等[32]構建了一個血管化的、包含hADSC和大鼠心肌細胞的復合物，發現ADSC在體內分化為心肌細胞，并與一同植入的大鼠心肌細胞融合，并參與了新生血管的形成。Metzele等[33]將hADSC與新生鼠的心肌細胞進行共培養，發現在細胞融合后，ADSC不僅能自我更新，還可以和心肌一樣呈節律性收縮、產生動作電位，由此推論細胞融合可能是心臟組織中心肌細胞自我更新的機制之一。Bagno等[34]向冠脈結扎的大鼠心室壁注射ADSC，發現心功能較對照組顯著提高。Cai等[35]用阿托伐他丁在心梗早期進行預處理后發現，ADSC的移植和分化效率均明顯提高。

6.2 去分化脂肪細胞

將成熟脂肪細胞進行“天花板”培養，部分貼壁的細胞吐出脂滴，最終形成成纖維細胞樣的去分化脂肪（Dedifferentiated fat，DFAT）細胞[36]，并具備多向分化潛能[37]。 Jumabay 等[38]將DFAT細胞移植到大鼠的心梗區域，8周后在移植的細胞中檢測到心肌標志物，梗死區周圍毛細血管密度增高。在隨后的體外培養中，他們又意外發現小鼠白色脂肪的DFAT細胞能夠自發地分化成節律跳動以及靜止的心肌細胞，它們表達心肌表面標志，并能穩定增殖，具有4期自動除極化，對心血管活性藥物有明顯反應[39]。DFAT細胞來源廣泛，自體可取，分化增殖能力幾乎不受供體年齡影響，與ADSC相比，DFAT細胞來源于純度達99.9%的成熟脂肪細胞，更加均一，使得DFAT細胞非常適合應用于細胞移植。然而，由DFAT細胞分化而來的心肌細胞僅在表面標志物、電生理特征方面進行了初步研究，其去分化和再分化的機制尚未闡明，對DFAT細胞進行更為深入的研究是十分必要的。

6.3 棕色脂肪來源的心肌前體細胞

Yamada等[40]首次發現在棕色脂肪組織中存在心肌前體細胞（Brown adipose tissue-derived cardiac progenitor cells，BATDCP）。從分離方法上看，BATDCP是對ADSC進一步的篩選、分離后所得到的細胞，但是由于棕色脂肪在成年個體中含量及活性有限，不符合Gimble等[41]提出的適用于再生醫學種子細胞的理想標準。Liu等[42]改進了Yamada的分離方法，提高了BATDCP的產率；另外，有研究證明，ADSC和MSC一樣具有免疫調節作用[43]，不引起細胞毒性免疫反應，并可抑制炎癥，已用于移植物抗宿主病的治療[44]，使得利用棕色脂肪中的心肌前體細胞進行自體或異體移植成為可能。

7 其他種子細胞

Koyanagi等[45]報道，將從外周血分離出的人內皮祖細胞與大鼠心肌細胞共培養，可使其分化為心肌細胞，用Wnt5a激活PKCδ可以增強其心肌標志的表達[46]。有研究報道，內皮祖細胞移植后，通過新生血管形成和新生心肌形成兩種機制，可修復梗死心肌[47]。Lin等[48]認為，從人月經血和子宮內膜中可分離出表達 Oct-4、SSEA-4、Nanog、c-kit的間充質干細胞，它們周期性自我更新、生成血管并分泌多種生長因子，可分化為自主搏動的心肌細胞，移植后未發現腫瘤形成及排斥反應的發生。Ge等[49]利用人羊膜間充質干細胞重編程的iPS成功誘導為心肌細胞。此外，人生精細胞在體外可以轉變成ES樣、具有三系分化潛能的多能干細胞[50]。因其具有良好的可塑性，無免疫原性，不存在倫理學問題等諸多優點，未來的應用前景十分光明，但致瘤性的相關研究還有待進一步深入和完善。目前，這些研究尚處于探索階段，尚未用于心臟疾病的治療，但是為心肌再生提示了一條可能的途徑。

隨著研究的深入，心肌再生的干細胞治療在再生醫學領域已有長足的發展，它們未來的臨床應用也具備無限的可能。但是，對細胞的誘導方法還必須進一步研究和改進，以提高心肌細胞的產率，降低培養成本；對誘導和分化機制必須進行更深層次的研究和探討，從而保證細胞在臨床上應用的安全性和可靠性；對理想的新型種子細胞的探尋仍需繼續；制定細胞治療相關標準、進行規范化的臨床前研究以及生物安全性研究，同樣是今后的研究重點。盡管面臨很多問題和挑戰，但心肌再生將成為未來心肌疾病治療的必然趨勢。

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Seed Cells for Cardiomyocyte Regeneration

CHEN Lei,DENG Zijun,LI Yunquan,YANG Xiangqun.Department of Human Anatomy,Institute of Biomedical Engineering;Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

YANG Xiangqun(E-mail:yangxq@smmu.edu.cn).

Myocardium;Regenerative medicine;Seed Cells

Q813.1+1

B

1673－0364（2012）05－0288－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.013

國家自然科學基金（31170934）。

200433 上海市 第二軍醫大學解剖學教研室，生物醫學工程研究所。

楊向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。

【Summary】Many researches demonstrated that cell transplantation has become an alternative therapy for myocardial diseases in a new direction.Myocardial regeneration was once considered being faced with mountains of difficulties.However,recently,with the advancing study in seed cells,it becomes possible for cardiomyocyte regeneration.The seed cells used in myocardial regeneration was reviewed in this paper.

2012年8月4日；

2012年9月12日）