陽和湯體外對大鼠成骨細胞及破骨細胞增殖的影響*

黃立中 王云丹 田 莎 伍參榮 彭吉勇 毛 丹 呂 宇

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007；2.湖南省長沙市中醫院，湖南 長沙 410100）

骨轉移癌最常見的表現為進行性骨痛、病理性骨折。為探討陽和湯抗骨轉移癌的作用機制，筆者通過體外分離培養的成骨細胞及體外誘導的破骨細胞體系，研究含藥血清對大鼠成骨細胞及破骨細胞的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 2 d齡SD大鼠 （分離成骨細胞用），3月齡的SD大鼠 20只（制備載藥血清用），體質量（200±50）g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物 陽和湯由鹿角膠、肉桂、白芥子、熟地黃、麻黃、姜炭、生甘草組成，經水煎醇沉后濃縮而得實驗用藥，生藥含量為1.5 g/mL。藥材購置于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。

1.3 試藥與儀器 胎牛血清，DMEM培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS），5 mg/mL 四甲基偶氮唑鹽 MTT （Sigma）， 二甲基亞砜（DMSO 分析純），DMEM 培養液（GBICO），區拉同 X-100（上海瑞金生物公司），對硝基苯酚（上海瑞金生物公司），M-CSF（Sigma公司），RANK-L（Sigma公司）。低速離心機（長沙平凡儀器儀表公司），水浴箱（上海精宏實驗設備公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司），CO2培養箱（2300 型，USA），倒置顯微鏡（南京江南光電公司），酶聯免疫檢測儀（Austria）。

1.4 陽和湯含藥血清制備 20只SD大鼠隨機分為4組，即空白對照組（給予蒸餾水灌胃），陽和湯高劑量組 12 g/（kg·d）、中劑量組 4 g/（kg·d）低劑量組 1.3 g/（kg·d），每組 5 只。 各組連續7 d灌胃給藥，末次給藥2 h后，予巴比妥鈉麻醉大鼠，行腹主動脈采血，分離血清，56℃滅活30 min，用0.22 μm過濾除菌，分裝標記后置4℃冰箱備用。

1.5 大鼠成骨細胞分離和培養［1］取2 d齡SD乳大鼠，在無菌條件下，分離顱頂蓋骨，剔除骨膜及其他組織，用D-Hank’s液沖洗3次，用眼科剪將骨片剪成1 mm×1 mm的碎塊，加入0.25%的胰蛋白酶，于37℃消化30 min，棄上清液，D-Hank’s沖洗3次，加入含0.05%胰蛋白酶及2 mg/mL的Ⅰ型膠原酶的消化液，37℃消化2 h，吸取消化液，經140目尼龍網過濾，再用DMEM培養液沖洗消化的骨殘集，收集沖洗液，過濾后與消化液混合，以1500 r/min離心15 min，收集細胞，即為新鮮的成骨細胞，加入含10%小牛血清的DMEM培養基，調整密度為1×105細胞/mL，接種于100 mL的培養瓶中，置37℃，5%CO2的孵箱中培養。24 h后換液。以后視細胞生長情況2～3 d換液1次。

1.6 大鼠破骨細胞分離和培養［2］取2 d齡SD乳大鼠5只，無菌取四肢長骨，放入含青、鏈霉素的冷D-Hank’S平衡鹽溶液中，小心剝離肌肉組織，將軟組織去除干凈，洗2～3次，并將干骺段剪去，然后將骨置于5 mL含10%小牛血清的DMEM培養基，先橫向剪成4～5 mm長的骨段，再縱向剪開暴露骨干內側，用吸管反復吹打5～10 min，使貼附在骨基質上的破骨細胞脫落下來，收集含骨髓細胞的培養液，于35 mm培養皿中靜置10 min，收集未貼壁的細胞懸液過200目細胞篩，以1000r/min離心10min，棄去上清液，所得白色沉淀物即為制得的破骨細胞樣細胞團。用含10%小牛血清的DMEM培養液重懸細胞，吹打均勻，將細胞懸液通過200目細胞篩，去除可能存在的非破骨細胞和雜質成分。然后將濾過后的細懸液調成1×106/mL濃度，吹打均勻后，接種到培養瓶中，置于37℃，含5%CO2飽和濕度的培養箱內進行培養。12 h后換液，以去除紅細胞和未貼壁細胞，每2日換液1次，生物倒置顯微鏡觀察細胞形態并照相。

1.7 MTT測定［3］藥物對細胞增殖的影響：原代成骨細胞（細胞傳至第3代用于實驗）、成骨細胞株UMR106和破骨前體細胞RAW264.7分別接種于96孔培養板，每孔加入100 μL細胞懸液（1×105個/mL），每個培養板分為 5 組，每組設 6 復孔，置 37℃、5%CO2孵箱培養24 h，使細胞貼壁后，用D-Hank’s洗滌3次，進行隨機分為空白血清組：加不含藥大鼠血清50 μL+20%DMEM 100 μL；陽和湯含藥血清高劑量組：加陽和湯高劑量血清50 μL+20%DMEM 100 μL；陽和湯含藥血清中劑量組：加陽和湯中劑量血清50 μL+20%DMEM100 μL；陽和湯含藥血清低劑量組：加陽和湯低劑量血清50 μL+20%DMEM100 μL；陰性細胞對照組：為不加藥，不加大鼠血清的常規培養陰性對照組。繼續培養24、48、72 h后，凋零孔加PBS液，并于結束培養前4 h每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h后小心吸棄培養液，再在每孔加入150 μL DMSO，充分震蕩5 min，使結晶物充分溶解，于酶聯免疫檢測儀上490 nm波長處測各孔吸光度值，計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）＝實驗組 A490/正常對照組 A490×100%。

1.8 破骨前體細胞形態觀察及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性測定［4］RAW264.7接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液（1×105個/mL）。 各孔 RAW264.7細胞加誘導體系（M-CSF 和RANK-L）的同時分別加入不同濃度的陽和湯含藥血清和空白血清各10 μL，37℃ 5%CO2培養，細胞每3日換液1次，同時設不加血清藥只加誘導體系的空白對照。第4日開始對只加誘導體系的空白對照細胞進行TRAP染色，生物光鏡觀察破骨細胞形態。另一部分培養細胞在培養第4日，第5日，第6日，分別測定TRAP酶活測定。其操作過程為：首先PBS沖洗細胞2次，加入20 μL，0.1%的區拉通5 min以裂解細胞，取上清，隨后加入反應液50 μL（稱取對硝基苯酚磷酸二鈉0.4 g，加入酒石酸甲鈉2.0 g，用 1 mol/L 的 HCl調 pH3.5，至終體積為 200 mL），37℃反應30 min，迅速加入1 mol/L的NaOH 100 μL終止反應。于530 nm處測其吸光度。標準曲線為不同濃度的對硝基苯酚溶液在530nm處的吸收值與濃度所作的標準曲線，以每孔生成的對硝基苯酚的摩爾數表示TRAP活性。

1.9 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件。各組數據以（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 陽和湯含藥血清對原代成骨細胞及UMR106細胞增殖的影響 見表1～表2。除了低劑量、24 h時間點外，各濃度各時間點吸光度均有顯著上升；對UMR106細胞株增殖影響情況與原代細胞類似。各含藥血清組與空白對照組同時間內比較、或同組不同時間內比較差異均有統計學意義（P＜0.05），含藥血清對原代成骨細胞和成骨樣細胞株UMR106的增殖具有顯著促進作用。

表1 各組原代成骨細胞增殖率比較（n＝6，±s）

表1 各組原代成骨細胞增殖率比較（n＝6，±s）

與空白血清組比較，*P＜0.05。下同。

24h 48h 72h A值 增殖率（%） A值 增殖率（%） A值 增殖率（%）空白血清組 0.31±0.01 100.00±0.00 0.50±0.02 100.00±0.00 0.63±0.03 100.00±0.00陽和湯含藥血清低劑量組 0.32±0.01 103.13±0.08 0.54±0.02 109.02±0.07* 0.71±0.04 113.12±0.05*陽和湯含藥血清中劑量組 0.34±0.01 110.04±0.09* 0.59±0.03 119.05±0.07* 0.71±0.04 113.30±0.07*陽和湯含藥血清高劑量組 0.34±0.02 110.12±0.10* 0.62±0.04 123.79±0.09* 0.74±0.04 118.41±0.04*組別

2.2 陽和湯含藥血清對原代破骨細胞分化能力的影響 破骨前體細胞形態破骨細胞增殖和分化能力是影響其骨吸收的重要方面，在生物倒置顯微鏡顯微鏡鏡下：原代破骨細胞培養第4日出現偽足，核大圓；第5日細胞多角形，核1個；培養第6日破骨細胞形態呈花瓣狀，可見2～3核（見圖1）。

表2 各組UMR106成骨細胞增殖率比較（n=6，±s）

表2 各組UMR106成骨細胞增殖率比較（n=6，±s）

24h 48h 72h A值 增殖率（%） A值 增殖率（%） A值 增殖率（%）空白血清組 0.32±0.01 100.00±0.00 0.49±0.03 100.00±0.00 0.66±0.02 100.00±0.00陽和湯含藥血清低劑量組 0.33±0.01 103.11±0.05 0.55±0.01 112.42±0.05* 0.72±0.02 109.21±0.06*陽和湯含藥血清中劑量組 0.35±0.01 109.47±0.05* 0.57±0.02 117.16±0.07* 0.76±0.01 115.37±0.05*陽和湯含藥血清高劑量組 0.37±0.02 116.62±0.08* 0.62±0.02 126.49±0.08* 0.81±0.04 122.70±0.08*組別

圖1 原代破骨細胞生長形態觀察（40×10）

利用TRAP染色觀察藥物對破骨前體細胞增殖和分化能力的影響，結果可見空白血清組細胞增殖、分裂活躍；陽和湯含藥血清高劑量組破骨核分化能力降低，細胞出現凋亡；陽和湯含藥血清中劑量組破骨核分化能力降低，出現細胞腫脹；陽和湯含藥血清低劑量組破骨胞形成弱低于空白血清組，如圖2。

圖2 （40×10）

2.3 陽和湯含藥血清對破骨前體細胞RAW264.7細胞增殖的影響 見表3。陽和湯含藥血清低劑量組破骨前體細胞RAW264.7增殖率與空白組比較24、48、72 h差異均無統計學意義 （P＞0.05）；陽和湯含藥血清中、高劑量組破骨前體細胞RAW264.7增殖率均低于空白血清組，24、48、72 h比較差異有統計學意義 （P＜0.05），提示陽和湯抑制破骨細胞的增殖有劑量-效應。

表3 各組RAW264.7細胞增殖率比較（n=6，±s）

表3 各組RAW264.7細胞增殖率比較（n=6，±s）

24h 48h 72h A值 增殖率（%） A值 增殖率（%） A值 增殖率（%）空白血清組 0.31±0.01 100.00±0.00 0.49±0.03 100.00±0.00 0.66±0.02 100.00±0.00陽和湯含藥血清低劑量組 0.31±0.01 100.11±0.05 0.48±0.04 97.59±0.12 0.65±0.01 97.24±0.03陽和湯含藥血清中劑量組 0.30±0.01 96.77±0.05* 0.47±0.03 95.91±0.09* 0.64±0.03 95.97±0.08*陽和湯含藥血清高劑量組 0.30±0.01 95.72±0.05* 0.46±0.02 92.39±0.07* 0.64±0.01 95.90±0.05*組別

2.4 陽和湯含藥血清對破骨前體細胞TRAP活性的影響 見表4。由表4知，與空白血清組相比，陽和湯含藥血清各劑量組24 h TRAP活性差異無統計學意義（P＞0.05）；陽和湯含藥血清低劑量組對破骨細胞的TRAP活性24、48 h影響不大，與空白組比較無顯著差異（P＞0.05），但72 h TRAP活性低于空白血清組（P＜0.05）；陽和湯含藥血清中劑量組、高劑量組48、72 h破骨細胞TRAP活性均明顯低于空白血清組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表4 各組破骨細胞 TRAP活性比較（n=6，μ/L，±s）

表4 各組破骨細胞 TRAP活性比較（n=6，μ/L，±s）

組 別 24 h 48 h 72 h空白血清組 27.21±1.26 38.01±2.24 40.47±2.80陽和湯含藥血清低劑量組 27.20±1.41 37.90±1.58 38.80±2.85*陽和湯含藥血清中劑量組 26.71±1.92 35.81±1.87* 36.61±1.64*陽和湯含藥血清高劑量組 26.83±1.73 34.99±1.75* 35.46±2.42*

3 討 論

正常骨代謝過程是一種骨吸收和骨形成的動態平衡過程，這一過程受到體內外許多因素的調控，任何不良因素均會導致骨代謝受阻。正常的骨代謝是通過成骨細胞的成骨作用與破骨細胞的骨吸收作用進行調節，在這個過程中，大量的相關因子參與其中，成為骨微環境主要部分。研究表明，大部分乳腺癌患者的骨轉移為溶骨性轉移，約15%～20%的患者同時有成骨性特征［5］。溶骨性轉移中，骨的破壞主要是由破骨細胞引起的，腫瘤細胞的主要作用是分泌一系列因子來啟動和生成破骨細胞而溶骨。在體內骨微環境系統中，如果成骨細胞數目的增長到達一定比例，使機體產生相應細胞因子，從而對破骨細胞的形成分化產生抑制作用。因此，促進機體內骨形成和骨吸收之間出現正平衡，成為抗骨質破壞的重要治療機制［6］。

陽和湯源于王洪緒《外科證治全生集》，原方用于治療陰疽。中醫學認為，骨轉移癌局部腫塊堅硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不變等臨床特征，與“寒主收引、主凝滯、主痛”等中醫理論相符，屬陰寒證。黃立中教授在臨床用陽和湯加味治療骨轉移癌取得了明顯的療效［7］，王氏［8］用陽和湯加味合云克治療骨轉移癌 30例。施氏［9］用陽和湯合帕米磷酸二鈉（博林針）治療惡性腫瘤31例也取得一定療效。本實驗采用中藥血清藥理學方法，探討了陽和湯對成骨細胞增殖的影響作用；對破骨前體細胞增殖、分化以及TRAP活性的影響。研究結果表明：陽和湯含藥血清不僅可以明顯促進成骨細胞的增殖，同時，可抑制破骨前體細胞增殖，降低破骨前體細胞TRAP活性，提示陽和湯含藥血清抑制破骨前體細胞增殖，降低破骨前體細胞TRAP活性，對成骨細胞的增殖具有顯著促進作用。這可能是陽和湯抗骨轉移癌的重要作用機制，為陽和湯抗骨轉移癌的臨床應用提供了理論依據。

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