不同毒力結核分枝桿菌感染小鼠對肺泡巨噬細胞的凋亡率及其時相性變化的影響①

董江濤 徐 芳 田璽擇 姚 楠 吳 芳 章 樂 王遠志 曹旭東 張萬江

(石河子大學醫學院免疫學教研室/石河子大學新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，石河子832002)

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種世界性傳染病，也是單一致病菌感染導致死亡率最高的感染性疾病。結核分枝桿菌感染人體后，主要被宿主巨噬細胞吞噬，未被機體免疫系統清除而潛伏下來的結核分枝桿菌，主要在宿主巨噬細胞內存活和繁殖［1］。因此對不同毒力的結核桿菌感染的不同時期機體免疫細胞凋亡率的研究，可為深入了解結核病的免疫發病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，6～8周齡，體重(18±2)克，雌雄各半，共80只，購自石河子大學實驗動物中心。

1.2 菌株 結核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 主要試劑與儀器設備 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國Biovision公司)、流式細胞儀 、生物安全柜、激光共聚焦顯微鏡、Mycobacterium tuberculosis 16 kD antibody(只針對結核分枝桿菌的16 kD的小鼠單克隆抗體)、FITC熒光二抗(山羊抗小鼠)。

1.4 實驗分組 將實驗小鼠隨機分為結核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株組和卡介苗菌株組，每組按感染模型復制成功后 1、3、5、7、9、11、13、15天設置8個時間點，每個時間點各設5只小鼠，每種菌株組為40只小鼠。

1.5 小鼠感染模型建立及鑒定 在生物安全柜內，以滅菌接種環取改良羅氏固體培養基上生長2～3周狀態良好的結核分枝桿菌菌落，置滅菌磨菌器中，加少量0.05%Tween-20的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。麥氏比濁法調細菌濃度約1.0×107個/ml。將不同菌懸液經小鼠尾靜脈分別注射到對應分組的每只小鼠體內，注射量約為0.3 ml。感染小鼠置生物安全三級實驗室內，IVC籠具中飼養。

1.6 小鼠肺泡巨噬細胞的收集 方法參照文獻［2］并加以改進，在上述不同時間點，將小鼠脫頸處死，經眼后放血，暴露支氣管，用消毒好的剪刀在氣管上做一切口(切勿剪斷)，用連有注射器的無菌軟皮管從切口處插入氣管，絲線固定，用4℃預冷PBS液行氣管肺泡灌洗，每次1 ml，共10次，離心管收集支氣管肺泡灌洗液，4℃ 1 500 r/min離心10分鐘，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，轉入細胞培養瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培養4小時，貼壁細胞即為小鼠肺泡巨噬細胞。

1.7 激光共聚焦顯微鏡觀察各組小鼠肺泡巨噬細胞

1.7.1 細胞爬片 收集小鼠肺泡巨噬細胞，用10%胎牛血清的DMEM培養液重懸，將細胞懸液均勻鋪到六孔板(內置預先滅菌處理過的蓋玻片)中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養4小時。

1.7.2 細胞固定 取出蓋玻片，用PBS侵洗，然后放入4%多聚甲醛固定液中室溫下靜置固定15分鐘，蒸餾水沖洗3次。

1.7.3 固定好的細胞玻片放入濕盒中，滴加山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體，勿沖洗。

1.7.4 滴加稀釋后的一抗(稀釋度1∶1 500)，均勻鋪在玻片上，濕盒內放置，4℃過夜。

1.7.5 PBS沖洗3分鐘，3次，滴加熒光二抗(稀釋度1∶500)，室溫2小時，PBS沖洗干凈，硝酸甘油封片。

1.7.6 激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強度及著色部位。

1.8 應用流式細胞技術檢測各組、各時間點小鼠肺泡巨噬細胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明操作：按上述方法獲得細胞培養瓶內培養4小時的貼壁小鼠肺泡巨噬細胞，倒掉上清液，加入PBS洗滌一次，用胰酶消化使貼壁細胞懸浮，1 000 r/min離心10分鐘，棄培養基。用500 μl 1×Binding Buffer懸浮肺泡巨噬細胞。在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2℃ ～8℃避光條件下孵育15分鐘。加入10 μl PI后輕輕混勻于2℃ ～8℃避光條件下孵育5分鐘。在1小時內用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 應用激光共聚焦顯微鏡觀察各組感染小鼠肺泡巨噬細胞 感染小鼠肺泡巨噬細胞內結核分枝桿菌膜上的小分子熱休克蛋白Hsp16.3與一抗(只針對結核分枝桿菌的16 kD的小鼠單克隆抗體)結合，再與FITC(綠色熒光)標記二抗結合。在激光共聚焦顯微鏡下，結核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬細胞內均可見大量綠色熒光(見圖1和圖2)，表明結核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株被小鼠肺泡巨噬細胞大量吞噬。

2.2 利用流式細胞技術檢測 結核分枝桿菌H37RV株和BCG菌株分別感染小鼠后，各感染組小鼠肺泡巨噬細胞凋亡結果見圖3，H37Rv和BCG菌株感染組均出現巨噬細胞的凋亡率逐漸升高至第9天時達到最大的變化趨勢，見表1。

圖1 BCG菌株感染小鼠肺泡巨噬細胞激光共聚焦顯微鏡檢測結果(×400)Fig．1 BCG strains of mice infected identification copied，and extracted mouse alveolar macrophages in the co focal microscope morphology(×400)

圖2 結核分枝桿菌H37Rv菌株感染小鼠肺泡巨噬細胞激光共聚焦顯微鏡檢測結果(×400)Fig．2 Infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strains of mice identification copied，extracted mouse alveolar macrophages in the co focal microscope morphology(×400)

圖3 結核分枝桿菌H37Rv和BCG菌株分別感染小鼠肺泡巨噬不同時間點細胞流式細胞術的檢測結果圖Fig．3 The results of flow cytometry detecting mouse alveolar macrophages infected by M．tuberculosis H37Rv and BCG strain at different time points

表1 H37Rv組和BCG組小鼠肺泡巨噬細胞凋亡率(n=5，%，±s)Tab．1 The apoptosis rate of Mouse alveolar macrophages at different time，in group H37Rv and BCG(n=5，%，±s)

表1 H37Rv組和BCG組小鼠肺泡巨噬細胞凋亡率(n=5，%，±s)Tab．1 The apoptosis rate of Mouse alveolar macrophages at different time，in group H37Rv and BCG(n=5，%，±s)

Time(d)H37Rv group BCG group 1 1.68±0.28 0.60±0.09 3 6.46±0.39 0.84±0.22 5 7.19±0.34 1.63±0.97 7 12.80±0.56 1.49±0.77 9 17.41±0.68 2.49±0.72 11 12.61±1.53 1.13±0.99 13 3.38±1.28 1.16±0.28 15 2.23±0.18 0.57±0.12

3 討論

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種世界性傳染病，也是單一致病菌感染導致死亡率最高的感染性疾病。結核病的致病菌——結核分枝桿菌是典型的胞內致病菌，主要在巨噬細胞等宿主免疫系統的細胞內存活和繁殖，但目前機體抗結核的免疫機制尚不清楚，有待進一步的探索和研究。

結核分枝桿菌小分子熱休克蛋白(sHSPs，small heat shock proteins)HSP16.3是近年研究發現的結核分枝桿菌中一個存在于膜上的主要抗原蛋白，一個組成性表達蛋白，正常條件下有少量表達，在結核分枝桿菌被宿主巨噬細胞吞噬后進入靜止生長期時結核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16.3顯著表達［3］，本實驗首先通過感染小鼠肺泡巨噬細胞內結核分枝桿菌膜上的小分子熱休克蛋白HSP16.3與一抗(只針對結核分枝桿菌的16 kD的小鼠單克隆抗體)特異性結合，再與FITC(綠色熒光)標記二抗結合，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見結核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬細胞內均有大量綠色熒光，證明H37Rv菌株和BCG菌株通過尾靜脈進入小鼠體內可被肺泡巨噬細胞大量吞噬。然后通過流式細胞技術檢測結核桿菌國際標準強毒力株H37Rv感染組和BCG感染組的巨噬細胞凋亡率，均呈現出1～9天內的逐漸升高，至9天時最高，分別為17.41%和2.49%，9天以后，凋亡率逐漸降低的趨勢，結核分枝桿菌標準強毒株H37Rv株感染組巨噬細胞的凋亡率明顯高于 BCG感染組，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可見，結核分枝桿菌感染宿主后，主要被宿主巨噬細胞吞噬，未被機體免疫系統清除而潛伏下來的結核分枝桿菌，也主要寄生于宿主巨噬細胞內。宿主巨噬細胞在結核分枝桿菌與宿主相互作用的過程中具有重要作用，結核分枝桿菌感染的后果以及結核病的發生與否與宿主巨噬細胞密切相關。宿主巨噬細胞發生凋亡后，可殺死寄生于其內的結核分枝桿菌，阻止結核分枝桿菌在體內的播散，并能激活鄰近未感染的巨噬細胞，增強機體對結核分枝桿菌的殺傷能力。因此，巨噬細胞的凋亡情況對于寄生于其中的結核分枝桿菌的命運至關重要。結核分枝桿菌要想成功地在宿主巨噬細胞中存活，就必須通過某些機制對宿主巨噬細胞的凋亡進程進行干預和調控，這有待于進一步探討和研究。

在結核分枝桿菌感染的過程中，結核分枝桿菌與宿主巨噬細胞相互作用及相互適應，可調控宿主巨噬細胞的凋亡。目前關于結核分枝桿菌干預和調控巨噬細胞凋亡的途徑和機制尚不清楚，在結核菌感染的早期巨噬細胞凋亡率不高，可能是由于巨噬細胞大量地凋亡將不利于巨噬細胞提呈抗原，機體主要通過這段時間建立有效的抗結核細胞免疫效應。隨著機體免疫效應的建立，巨噬細胞通過自身的凋亡達到殺死和清除結核分枝桿菌的目的，結核菌感染宿主巨噬細胞凋亡率逐漸升高，最終達到頂峰［4］。結核分枝桿菌可誘導巨噬細胞凋亡的同時，也具有抑制巨噬細胞凋亡的作用，當這兩種作用達到平衡時，結核分枝桿菌則以休眠狀態存在于巨噬細胞中，形成所謂的“逃避”，使自身的存活、繁殖與宿主的一系列免疫反應達到一種動態平衡［5］，因此，結核病的發生與發展過程中，時刻伴隨機體免疫細胞的凋亡是機體與結核分枝桿菌之間相互斗爭的結果。對結核分枝桿菌與宿主巨噬細胞調控作用的機制研究，為闡明結核病的發病機制奠定基礎。

1 Metro G，Saba A，Gupta T D et al.Chaperone-mediated inhibition of tubulin self-assembly［J］.Proteins，2007;67(1)：112-120.

2 陳秀芳，金麗琴，呂建新et al.蟬擬青霉對大鼠腹腔及肺泡巨噬細胞的激活作用［J］.中國病理生理雜志，2002;18(6)：694-697

3 Fu X，Chang Z.Identification of a highly conserved pro-gly doublet in non-animal small heat shock proteins and characterization of its structural and functional roles in Mycobacterium tuberculosis Hsp16.3［J］.Biochemistry(Mosc)，2008;71(Suppl 1)：S83-S90.

4 Keane J，Remold H G，Komfeld H.Virulent mycobacterium tuberculosis strain evade apoptosis of infected alveolar macrophage［J］.J Immunol，2000;164(4)：2016-2020

5 Rengarajan J，Bloom B R，Rubin E J.Genome wide requires for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages［J］.Proc Natal Aced Sic USA，2005;102(23)：8327-8332.