骨髓造血細胞島在免疫相關性血細胞減少患者中的異質性研究①

孫黎飛 韓 冰 李 鋼 吳強強 郝紅峰 明 匯 張金標

(解放軍第148醫院腫瘤中心，淄博255300)

幼紅細胞造血島(Erythroblastic islands，EI)增多是免疫相關性血細胞減少(IRH/IRP)骨髓特征之一。國內研究發現該類患者骨髓單個核細胞(BMMNC)Coombs試驗陽性，島中的巨噬細胞與幼紅細胞之間連接處有抗人球蛋白抗體沉淀，并有巨噬細胞吞噬幼紅細胞現象，所以提出IRP中的EI可能是該類患者骨髓幼紅細胞“原位溶血”的重要原因［1，2］。為了進一步研究IRH/IRP血細胞破壞和減少的免疫機制，本文觀察了骨髓涂片中出現“造血細胞島”(Hematopoietic islands，HI)現象的 IRH/IRP病例，結合患者相關免疫指標，分析HI異質性的可能原因，探討IRH/IRP發病的相關免疫機制及臨床意義。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 106例IRH/IRP(排除再生障礙性貧血、陣發性睡眠性血紅蛋白尿和骨髓增生異常綜合征)患者骨髓片均采自我院自2008年以來初診的患者，常規瑞氏染色法篩選出37例伴有造血細胞島(HI)現象的骨髓片進行研究。其中血沉和/或IgG升高者12例，血清HLA-B27抗原升高者6例，血沉、IgG和血清HLA-B27抗原同時升高患者14例，HLA-B27抗原、血沉及IgG均不升高IRH/IRH患者5例。患者首次外周血Coombs試驗均為陰性，3例經糖皮質激素等藥物治療后三系正常，因感染導致疾病復發，復查Coombs直接試驗轉為陽性。

1．2 方法

1．2．1 骨髓片細胞化學染色 常規聯苯胺法行過氧化物酶(POX)染色，觀察患者HI中粒細胞和免疫細胞POX表達情況;亞鐵氰化鉀法行鐵染色，觀察HI中巨噬細胞或抗原提呈細胞(APC)漿內鐵染色狀態。

1．2．2 骨髓細胞MHCⅡ類分子HLA-DR抗原檢測 一抗羊抗人HLA-DR單克隆抗體、羊抗人補體抗體購自美國Beyotime公司，免疫化學堿性磷酸酶法染色試劑盒購自北京中杉金橋公司，參照試劑盒說明書步驟操作，Olympus BX40雙目顯微鏡(日本Olympus公司)觀察患者骨髓片中HI的免疫細胞胞漿內HLA-DR抗原(MHCⅡ類分子基因產物)表達情況。

1．2．3 免疫熒光法(IF)觀察HI中抗人球蛋白抗體表達 羊抗人IgG抗體、Cy3標記驢抗羊IgG熒光二抗IF固定液、熒光二抗稀釋液、熒光染色封閉液、熒光染色洗滌液均購自美國Beyotime公司，嚴格按照說明書步驟進行操作。Olympus BX51熒光顯微鏡觀察患者HI中造血細胞和免疫細胞胞漿內熒光抗體表達強度。營養性貧血骨髓片作為對照。

2 結果

2．1 造血細胞島的異質性 在紅細胞破壞嚴重的IRH/IRP患者骨髓片中，單純紅細胞克隆的幼紅細胞造血島多見，除此之外還伴有一些幼紅細胞、幼粒細胞和幼紅幼粒細胞型的HI。島中的免疫細胞和血細胞成分各異(如表1所示)。我們根據形態及功能學，將其主要分為以下幾種:

2．1．1 ADCC型HI37例患者骨髓中檢出ADCC型HI 21例(21/37，56．75%)。該型HI中的造血細胞多為幼紅細胞，三系嚴重降低的IRP患者骨髓中可出現幼粒細胞島和幼紅幼粒細胞島。島中免疫細胞為早幼粒、中幼粒、嗜酸性粒細胞和單核細胞(圖1A1～A3)，這些細胞的POX染色，依其生物學性質表現為弱陽性～陽性(圖1A2)，細胞膜上不表達MHCⅡ類分子，但幼紅細胞表面補體抗體陽性(圖1A4)。抗人IgG抗體IF可見幼紅、幼粒細胞膜上存在強陽性的紅色熒光，而島中的免疫細胞胞漿周圍與造血細胞接觸處呈顆粒狀強陽性表達(圖1A5)，呈現出抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC)現象。

2．1．2 巨噬細胞(Mφ)型HI 該型 HI在 IRH/IRP患者骨髓片中最多見，共檢出 26例(26/37，70．27%)，常與ADCC型HI同時出現。島中的Mφ呈活化狀態，并有吞噬血細胞現象(圖1B1)，POX染色陰性(圖1B2)，鐵染色可見Mφ吞噬鐵顆粒(圖1B3)。Mφ膜上HLA-DR抗體部分呈陰性表達(圖1B4)，而伴有感染的IRP患者Mφ則呈陽性表達。IF染色可見幼紅細胞膜周圍呈均勻陽性表達，島中Mφ與幼紅細胞相連的細胞漿內可見到團塊狀強陽性紅色熒光顆粒(圖1B5)。

2．1．3 抗原提呈型HI 在37例骨髓涂片中檢出12例(32．43%)有抗原提呈型HI。該型HI中造血細胞為幼紅和POX活性顯著減弱的幼粒細胞，抗原提呈細胞(APC)為 Mφ(圖1C1)和 DC(圖1C2)，APC的POX(圖1C1～C2)和鐵染色均為陰性(圖1C3)，胞漿HLA-DR強陽性(圖1C4)表達。IF顯示幼紅、粒細胞膜周圍和漿內抗人IgG抗體陽性，APC漿內可見到大量強陽性的紅色顆粒(圖1C5)。此外，此型患者骨髓片上活化狀態的淋巴細胞增多，淋巴細胞(CTL)攻擊粒細胞、幼紅細胞和血小板等靶細胞現象多見(圖1C6)，提示細胞免疫活化［1，3］。

表1 造血細胞島的異質性Tab．1 The heterogeneity of HI

2．1．4 漿細胞型HI 在6例血沉顯著升高(ESR＞100 mm/h)，伴有類風濕性關節炎、干燥綜合征等多種自身免疫性疾病的重癥IRP患者骨髓中檢出漿細胞型HI(圖1D1)。該類患者骨髓片中可見到較多同時出現的ADCC型和Mφ型HI。島中的漿細胞表面抗人IgG熒光抗體呈強陽性表達，幼紅細胞則呈均勻陽性表達(圖1D2)，其中2例患者成熟紅細胞也呈強陽性，漿細胞和紅細胞之間有強陽性抗體粘連帶(未顯示)。

2．1．5 幼粒細胞型HI 在伴有HLA-B27增高和粒細胞嚴重減少的IRH/IRP患者骨髓中有4例出現幼粒細胞型HI(圖1E1)。島中的幼粒細胞漿多有空泡變性，POX表達顯著減弱，免疫細胞多為體積較小的DC。抗人IgG免疫熒光染色可見幼粒細胞漿中呈均勻紅色顆粒狀陽性表達(圖1E2)。

圖1 造血細胞島細胞化學、免疫化學和免疫熒光染色結果(×1 000)Fig．1 Cytochemistry，Immunochemistry and Immunofluorescence staining of Hematopoietic islands(×1 000)

2．2 造血細胞島在骨髓中分布的異質性與疾病相關聯 不同類型的造血細胞島在IRH/IRP患者骨髓中出現的種類和數量不盡相同，并且與患者的病情有一定的關聯。37例IRH/IRP患者骨髓中以Mφ型HI最多見，且多與ADCC型HI同時出現在血沉增高的患者骨髓涂片中。12例抗原提呈型HI中有7例出現在HLA-B27和血沉均升高的IRP患者骨髓涂片中，3例為單純HLA-B27升高者，2例出現在HLA-B27和血沉均陰性的骨髓涂片中。而6例漿細胞型HI中有3例與ADCC型HI、Mφ型HI和抗原提呈型HI同時出現在重度IRP患者骨髓片中，且此類患者多伴有多種自身抗體的產生，病情重、易反復，在血象恢復后，應用糖皮質激素和免疫抑制劑維持治療的時間也較長。

3 討論

通常認為經典的幼紅細胞島“EI”是指紅細胞在骨髓分化發育過程中，幼紅細胞圍繞巨噬細胞形成的特殊的造血龕，龕中的巨噬細胞分泌各種細胞因子，為幼紅細胞提供生長微環境的同時，調節著幼紅細胞的增殖、分化和凋亡，并且是幼紅細胞鐵來源的主要途徑，是幼紅細胞生長發育的輔助場所。近年來的研究發現，在免疫相關性血細胞減少(IRH/IRP)患者骨髓中出現的EI，存在巨噬細胞吞噬幼紅細胞現象，這些被吞噬的幼紅細胞的膜表面存在抗人IgG抗體，由此推斷此類“EI”現象是幼紅細胞在骨髓中“原位溶血”的重要原因［4-6］。

我們的研究結果顯示，IRH/IRP患者骨髓涂片出現的這種“EI”現象多發生嚴重的溶血現象，在伴有IgG和血沉顯著增高的患者中，既存在與造血細胞破壞過多反饋性刺激幼紅細胞生成加速的“幼紅細胞克隆”和“幼紅細胞造血島”現象，同時還存在各種以不同免疫細胞為中心的幼紅細胞島、幼粒細胞島、幼紅幼粒細胞島。這些形式各異的造血細胞島中的免疫細胞，發揮不同的免疫效應，有別于經典的EI，因此將其稱為“造血細胞島”(Hematopoietic islands，HI)或“免疫相關性造血細胞島”(Immunorelated hematopoietic islands，IRHI)更為合適。

免疫熒光染色(IF)發現37例IRH/IRP患者骨髓涂片中HI血細胞膜上抗人IgG抗體均為陽性的紅色熒光，島中的免疫細胞以粘附、捕獲和吞噬等不同的形式與抗人IgG陽性的造血細胞接觸(它們之間產生了不同形式的強陽性紅色抗人IgG抗體熒光顆粒)，發揮免疫介導和/或免疫效應機制。這表明造血細胞膜抗原結構改變，使得機體產生抗人IgG抗體，在不同的致病因素刺激下，免疫細胞活化對病變的造血細胞的攻擊，是IRH/IRP產生HI現象的重要因素，亦是IRH/IRP發病的免疫機制之一。

在IRH/IRP疾病的發生過程中，由于各種致病因素致使造血細胞膜抗原結構改變，成為自身抗原激活B細胞產生特異性抗體啟動體液免疫應答和ADCC作用的同時啟動樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞(Mφ)對造血細胞膜上自身抗原的識別、粘附、捕獲、吞噬，誘導特異性CTL活化，啟動細胞免疫應答，這一過程在細胞因子構成的免疫網絡刺激下相輔相成。

NK細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核巨噬細胞等免疫(效應)細胞的表面存在FcR受體，可通過與造血細胞表面的抗人IgG的重鏈Fc段結合而活化，引發一系列的細胞反應，如吞噬免疫復合物、產生氧化爆發反應、釋放各種裂解活性的酶和細胞因子，殺傷造血細胞。因此，在ADCC型HI中，中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的POX強陽性，而島中的粒細胞則由于病變POX活性減弱。NK和粒細胞等效應細胞，不具備抗原提呈能力，故而不表達MHCⅡ類分子HLA-DR 抗原［1］。

由于Mφ既具備抗原提呈細胞(APC)的特性，又具備吞噬病原體和病變靶細胞的免疫效應細胞功能，所以它不但是體內發揮細胞免疫的重要細胞，而且也是IRH/IRP一類自身免疫性疾病對機體造成損傷的重要效應細胞。IF染色顯示巨噬細胞型HI內Mφ和造血細胞接觸處存在粗大的強陽性抗人IgG紅色熒光，結合細胞化學染色、免疫細胞化學染色，均顯示了巨噬細胞具有APC和吞噬功能效應細胞的兩種不同生物學特征［1］。由此推斷表達HLADR抗原的Mφ型HI是Mφ發揮吞噬作用的HI，而POX弱陽性或陽性、不表達HLA-DR抗原的巨噬細胞型HI則應屬于發揮ADCC作用效應細胞。

抗原提呈(AP)型HI中DC和Mф高表達HLADR，IF染色清晰地展示了APC細胞漿中捕獲的強陽性抗人IgG紅色熒光顆粒，進一步詮釋和證實了AP型HI在IRH/IRP發病中的免疫機制。血沉顯著升高伴有MHCⅠ類分子基因產物HLA-B27抗原升高的IRH/IRP患者骨髓片中，除出現分泌型漿細胞HI外，還伴有大量淋巴細胞(CTL)攻擊幼紅幼粒細胞和血小板的現象，提示患者體內存在體液免疫活化和細胞免疫免疫應答的雙重損害［2，3］。故此類患者病情重，單純糖皮質激素治療難以奏效，須聯合能抑制Th細胞增殖和活化的CsA。

綜上所述，我們的研究表明IRH/IRP造血細胞島的異質性是機體固有免疫和適應性免疫針對骨髓造血細胞膜表面結構變異，產生抗人IgG導致的病理性改變，在疾病的不同階段由不同免疫效應細胞所表現的不同免疫應答狀態。本研究反映了IRH/IRP疾病的體液免疫和細胞免疫免疫活化狀態的異質性和關聯性。我們認為在IRH/IRP中出現的HI與經典的“幼紅細胞島”有著本質的差異，是該類疾病骨髓造血細胞原位破壞的主要因素。同一骨髓片出現的不同造血細胞島的形式和數量，是患者體內體液免疫和細胞免疫活化的不同程度對造血細胞多重性損傷的生物學表現。

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5 劉 惠，付 蓉，李麗娟et al．骨髓單個核細胞Coombs試驗(+)血細胞減少癥患者有核細胞膜EPO受體與自身抗體關系的初步研究［J］．中華血液學雜志，2010;31(6):413-415．

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