IL-1β和IL-18在鼠巨細胞病毒播散性感染中的表達及意義①

李旭芳 劉玲玲 劉興樓 舒賽男 李 革 方 峰

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科，武漢430030)

人巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)在我國感染率很高，由于CMV是一種弱致病因子，多數感染者無癥狀或潛伏感染，但在免疫功能下降或缺陷時可引起疾病［1］。胎兒和新生兒全身播散性感染可致頭小畸形、智力障礙、生長發育遲緩和神經性耳聾、室間隔缺損等畸形;器官移植、艾滋病及其他免疫缺陷患者，可增加病死率和器官移植排斥率。迄今的研究證實病毒誘生的細胞因子在CMV致病性中發揮了重要作用［2］。研究發現多種細胞因子與CMV感染密切相關，如IL-6、IL-8、TNF、IFN及MIP-1α等［2］。近年來研究發現的炎性體能夠識別病原微生物后活化，使 procaspase-1轉化為活性形式caspase-1，并促進細胞因子IL-1β和IL-18的成熟釋放［3-7］，這兩種細胞因子主要參與多種自身免疫性疾病的炎性損傷過程并介導適應性免疫應答［8］。本研究旨在證實鼠CMV(Murine cytomegalovirus，MCMV)感染后炎性體活化并促進IL-1β和IL-18的成熟釋放，為探尋多靶點抗CMV感染的治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性BALB/c小鼠，4周齡，購自湖北省醫學科學院實驗動物中心，飼養在同濟醫院動物室潔凈層柜內。實驗前適應性飼養3天。

1.2 病毒 MCMV Smith株(美國德克薩斯大學健康衛生中心惠贈)在BALB/c小鼠唾液腺中增殖，唾液腺勻漿經空斑試驗測定病毒平均感染性滴度3×106PFU(plaque-forming unit)/ml。

1.3 實驗分組 實驗小鼠隨機分為播散性感染組和模擬感染對照組各16只。播散性感染組接種含MCMV 5×103PFU的唾液腺勻漿0.2 ml，模擬感染對照組接種等量正常唾液腺勻漿［9］。感染后第0(接種前)、3、7和14天，各組分別隨機處死4只小鼠。乙醚麻醉，眼球摘除取血后斷頸處死，無菌分離血清及脾、肝、肺和唾液腺等組織經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，部分脾組織－80℃冰箱保存。

1.4 標準空斑試驗檢測組織MCMV感染性滴度參照參考文獻［10］，采用本實驗室自制的小鼠胚胎肺成纖維細胞作為敏感細胞，檢測MCMV感染后3、7和14天小鼠肝、肺和唾液腺組織中MCMV感染性滴度。檢測低限為0.2 PFU/mg組織(濕重)。

1.5 Western blot法檢測脾細胞中caspase-1表達將分離的感染后0、3、7、14天的脾組織經蛋白裂解液裂解研磨后，應用BCA蛋白測定試劑盒測定裂解上清中的蛋白濃度。各樣本取50 μg蛋白上樣，經12%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白并轉至PVDF膜上。轉膜后用含0.05%Tween 20的TBS封閉2小時，分別用 caspase-1兔多克隆抗體(1∶400，BioVision 公司)及兔抗鼠GAPDH(1∶1 000，Santa Cruz公司)孵育過夜，羊抗兔結合HRP的特異性IgG二抗(1∶10 000，Santa Cruz公司)孵育 1小時后，化學發光法顯色曝光。采用HMIAS-2000型全自動醫學彩色圖像分析系統分析測定目的條帶的吸光值并分析與GAPDH條帶的相對吸光值。

1.6 ELISA法檢測血清IL-1β和IL-18水平 采用雙抗體夾心ELISA法檢測感染后0、3、7和14天分離的血清中IL-1β和IL-18(R＆D Systems)濃度。

1.7 免疫組化法檢測組織中IL-1β和IL-18表達唾液腺、肺、肝組織石蠟切片經脫蠟至水化后進行以下操作:抗原熱修復;0.3%H2O2阻斷內源性過氧化氫酶;正常小牛血清封閉20分鐘;分別加入抗鼠IL-1β(Peprotech公司，1∶100稀釋)和抗鼠 IL-18抗體(Biovision公司，1∶100稀釋)，4℃ 孵育過夜;加入生物素標記的羊抗鼠室溫孵育15分鐘;加入鏈霉素標記的生物素蛋白孵育10分鐘;DAB顯色5～10分鐘;蘇木紫復染;1%鹽酸酒精分化后脫水透明，中性樹膠封片。應用Olympus BX41顯微系統攝像。每個標本選擇3張切片，每張切片選擇5個高倍鏡視野(×200)進行觀察，對組織中IL-1β和IL-18陽性細胞數進行半定量分析，陽性細胞數以每高倍鏡視野中陽性細胞個數表示(cells/hpf)。

1.8 統計學方法 所有數據應用Microsoft Excel軟件分析，計量資料以x±s表示，兩組間比較應用t檢驗，雙側檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MCMV感染后組織病毒滴度 肝組織病毒滴度于MCMV感染后3天升高，其后迅速下降，14天即檢測不到;肺組織病毒滴度低于檢測低限，而唾液腺組織病毒滴度呈逐漸增高趨勢(圖1)。

2.2 Western blot法檢測脾細胞中caspase-1表達狀況 模擬感染對照組感染后procaspase-1和caspase-1的表達相對穩定;與模擬感染對照組相比，播散性感染組感染后3天 procaspase-1和caspase-1的表達明顯升高［相對吸光值分別為(1.226±0.355)vs(0.361±0.033)，t=4.22，P ＜0.01和(1.193±0.165)vs(0.332 ±0.095)，t=7.84，P ＜0.01］，隨后逐漸恢復正常(圖2)。

圖1 標準空斑試驗檢測MCMV感染鼠組織病毒滴度Fig.1 The levels of viral titer in tissues of MCMV-infected mice quantified by standard plaque assay

2.3 血清中IL-1β和IL-18水平 模擬感染對照組血清IL-1β和IL-18水平相對穩定;與模擬感染對照組相比，播散性感染組感染后3天血清IL-1β和IL-18明顯升高并達峰值［(分別為(112.72±5.20)vs(47.86±4.35)pg/ml，t=16.57，P ＜0.01和(42.74±4.23)vs(22.60 ±2.82)pg/ml，t=6.85，P ＜0.01］，隨后逐漸降至正常水平(圖3)。

2.4 免疫組化法檢測組織中IL-1β和IL-18表達模擬感染組和播散性感染組0天各組織中無IL-1β和IL-18陽性細胞;而播散性感染組感染后3天唾液腺組織中可見少量IL-1β和IL-18陽性表達細胞，并呈進行性增加，至感染后7天明顯增多達峰值，14天減少。而肺和肝組織僅于感染后3天可見少量陽性表達細胞，其后未見陽性表達 (圖4)。

圖2 Western blot檢測脾細胞中procaspase-1和caspase-1的表達狀況(A)及相對吸光值(B)Fig.2 The expressions of procaspase-1 and caspase-1 in spleen detected by Western blot(A)and the relative intensity(B)

圖3 ELISA法檢測血清中IL-1β(A)和 IL-18(B)水平Fig.3 The levels of IL-1β(A)and IL-18(B)in sera measured by ELISA

圖4 免疫組化法檢測組織中IL-1β(A)和IL-18(B)表達(×200)Fig.4 The expressions of IL-1β(A)and IL-18(B)in tissues detected by immunohistochemistry(×200)

3 討論

機體清除病原體的天然免疫應答需要巨噬細胞和抗原提呈細胞募集到感染部位，產生促炎細胞因子［11］。MCMV能夠誘導巨噬細胞中 AIM2(Absent in melanoma 2)炎性體介導的NF-κB和caspase-1的活化［12-14］。NF-κB 的活化能夠產生 TNF-α、IFN-γ等多種炎性因子，已有研究顯示這些炎性因子能夠明顯抑制肝細胞內病毒的復制而不損傷肝細胞，主要介導肝細胞非損傷性抗細胞內病毒效應［15，16］。

本組實驗證實了MCMV感染后3天procaspase-1的募集及轉化為活性caspase-1增加，同時其下游的炎性因子IL-1β和IL-18在血清中的成熟釋放明顯增加，說明了MCMV感染后炎性體形成及活化增加。IL-1β最初是作為內生致熱源被人們所認識，其與發熱、感染及損傷密切相關，能夠進一步誘導和激活很多炎性分子，如磷酸酯酶A2、花生四烯酸環氧合酶(COX)等從而造成組織損傷;此外，IL-1R信號的表達有助于Th17細胞的增殖，還能夠通過直接增強B細胞的增殖或間接上調T細胞共刺激分子的表達而增強體液免疫應答［17］。IL-18以往稱為IFN-γ誘導因子，主要增強Th1細胞的增殖及IFN-γ的產生;近年來的研究發現還能夠增強Th1細胞、NK細胞表達Fas配體而介導細胞毒作用，上調NF-κB的表達和活性，增強其他促炎因子的產生，加重局部組織繼發性損傷［18］。這些研究說明 IL-1β和IL-18在機體的免疫反應尤其是抗感染免疫中具有雙刃劍的作用。而本研究發現的IL-1β和IL-18在不同組織中的不均一性表達(尤其是唾液腺組織中明顯高表達)至少部分說明了這兩種細胞因子作用的靶細胞可能不同于 TNF-α、IFN-γ等，在肝、肺等臟器的炎性損傷中發揮非主導作用，這可能是由于不同的細胞因子環境影響了不同的靶器官的炎性反應及適應性免疫應答。

MCMV播散性感染模型的建立有助于闡明MCMV感染后特殊的細胞因子在介導炎癥反應及適應性免疫應答中的作用。IL-1β和IL-18具有明顯的促炎作用，而炎性體的活化、IL-1β和IL-18的產生又都是啟動適應性免疫應答的信號［7］，因此，對于IL-1β和IL-18在MCMV播散性感染中病毒滴度最高的唾液腺組織中呈現的高表達與局部組織的炎性反應及適應性免疫應答的相關性的深入研究，對于進一步認識多細胞因子網絡在MCMV感染致病性中的作用具有重要意義。

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