補(bǔ)腎活血復(fù)方對成骨細(xì)胞谷氨酸NMDA(N-methyl-D-aspartate)受體信號通路的影響

張 淼，張榮華，沈家珍

(暨南大學(xué)，廣州 510632)

目前在骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，有谷氨酸受體、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)子等谷氨酸信號通路組成成分，證實(shí)了谷氨酸信號通路存在于骨組織中[1、2]，因此谷氨酸信號通路在骨代謝中起重要作用。本研究從谷氨酸信號通路、骨骼的關(guān)系，以藥證理，即補(bǔ)腎中藥對谷氨酸信號通路的影響，探討中醫(yī)腎、骨、髓之間的病理生理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

NR1、NR2a、NR2d一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，MK801(Sigma)、PROTEAN電泳槽(Pharmacia)。

1.2 動物

3月齡SD(Sprague-Dawley)雌性大鼠，1d齡、5d齡SD大鼠，廣東省實(shí)驗動物中心提供(合格證號SCXK(粵)2008-0002)。

1.3 藥物

根據(jù)補(bǔ)腎活血復(fù)方生產(chǎn)工藝加工提供復(fù)方干膏。

2 方法

2.1 OB、OC的分離與培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[3、4]。

2.2 大鼠血清的制備

參照文獻(xiàn)[5]。

2.3 共育體系建立

參照文獻(xiàn)[6]。

2.4 分組

空白對照組(空白組)、補(bǔ)腎活血復(fù)方含藥血清組(含藥組)、補(bǔ)腎活血復(fù)方含藥血清+MK801組(含藥+MK801組)。

2.5 OB增殖測定

MTT法檢測。

2.6 ALP活性測定

ALP試劑盒檢測。

2.7 Western-blot檢測NR1、NR2a、NR2d蛋白含量

按實(shí)驗要求培養(yǎng)細(xì)胞后，提蛋白、定量、加樣、電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在TBST中浸泡2h，加一抗、洗膜，加二抗、洗膜，加入化學(xué)發(fā)光試劑曝光、顯影。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對OB增殖的影響

表1顯示，含藥組OD值較空白血清組增加，加入MK801后與含藥組比較OD值減少，P=0.000＜0.01，在統(tǒng)計學(xué)上均具有顯著意義。

表1 各組OB增殖情況

表1 各組OB增殖情況

注:與含藥組比較:*均P=0.000＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異

組別 例數(shù) OD值空 白 組 10 0.2622±0.0139*含 藥 組 10 0.5250±0.0303含藥+MK801組 10 0.3342±0.0183*

3.2 含藥血清對OB ALP活性的影響

表2顯示，含藥組和空白組比較ALP 明顯升高(P=0.000＜0.01)，加入 M K801后與含藥組比較降低(P=0.004＜0.01)，在統(tǒng)計學(xué)上均具有顯著意義。

表2 各組ALP活性

表2 各組ALP活性

注:與空白組比較:*P=0.000＜0.01，與含藥組比較:#P=0.004＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)差異

組別 例數(shù) ALP活性(金氏單位)2.162±0.202含 藥 組 8 3.125±0.608*含藥+MK801組 8 2.234±0.407空白組8#

3.3 含藥血清對OB的NR1、NR2a、NR2d蛋白含量影響

圖1顯示，含藥血清可以提高OBNR1、NR2a、NR2d蛋白含量，加入阻滯劑MK801后其含量有不同程度下降。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸及NR信號途徑對骨再建有重要調(diào)節(jié)作用[7]，谷氨酸可調(diào)節(jié)OB成熟和破骨細(xì)胞(OC)發(fā)生，誘導(dǎo)前體OB增殖，并通過核轉(zhuǎn)錄因子Cbfa-1促使其分化，從而促進(jìn)骨形成;可通過NF-κB介導(dǎo)分化OC，并抑制成熟OC的凋亡，增加其數(shù)量及骨吸收，其最終骨重建效應(yīng)取決于兩者的凈作用。NMDA可上調(diào)OB的數(shù)量，其受體阻斷劑則拮抗此效應(yīng);在體外培養(yǎng)OB中發(fā)現(xiàn)，加入NMDA拮抗劑后，可抑制OB的成熟、礦化。NR有3個家族即NR1、NR2包括NR2a-d 4型、NR3包括NR3a-b兩型，局部細(xì)胞NR是以NR1與1個或多個NR2和/或NR3亞基聚合的復(fù)合體。既往實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，OB有NR1蛋白的表達(dá)，而NR2亞基的表達(dá)因細(xì)胞提取方法不同而不盡相同。

圖1 OB細(xì)胞對NR1、NR2a、NR2d蛋白含量的影響

既往課題組實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血復(fù)方含藥血清在OB-OC共育體系中可提高OB ALP活性、刺激OB增殖[8]。本實(shí)驗借鑒以往的研究，選擇25%濃度為含藥血清的敏感濃度，用MTT法、ALP檢測試劑盒檢測OB的增殖和ALP活性;用Western-blot法檢測OB的NR1、NR2a、NR2d蛋白含量。實(shí)驗結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血復(fù)方含藥血清可以提高OB NR1、NR2a、NR2d蛋白的表達(dá)，刺激OB的增殖，提高ALP活性，加入MK801后OB NR1、NR2a、NR2d蛋白的表達(dá)、OB的增殖情況和ALP活性均下降，因此補(bǔ)腎活血復(fù)方含藥血清可以通過谷氨酸NR途徑，促進(jìn)共育體系OB的骨形成作用，同時揭示了補(bǔ)腎活血復(fù)方治療骨質(zhì)疏松的機(jī)理之一。

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