抵擋湯早期干預(yù)對2型糖尿病模型大鼠大血管病變 C D68、MCP-1、E-選擇素的影響＊

常 柏，甄 仲，潘從清，孟 東，常寶成，仝小林△

(1.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津 300020;2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

糖尿病大血管病變是糖尿病患者致死、致殘的主要因素。據(jù)報道在我國糖尿病患者中，糖尿病發(fā)病5年、5～10年和10年以上者，下肢血管病變發(fā)病率分別為22.6%、23%和66.7%[1]，單純控制血糖并不足以阻止大血管病變的發(fā)生和進展[2]。目前糖尿病大血管病變的機制尚不完全明確，一般認為動脈粥樣硬化(AS)為其主要病理基礎(chǔ)。而新近研究則表明，AS可能與炎癥有關(guān)，而不是單純的由于脂質(zhì)沉積所致[3]。炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生、發(fā)展，到最后斑塊表面破裂并發(fā)血栓形成的所有階段均發(fā)揮了作用[4]。為探討高血糖狀態(tài)下抵擋湯早期干預(yù)對糖尿病大血管的炎性細胞趨向性的影響，我們開展了動物實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Vistar大鼠140只，4周齡，體重100.30g±2.19g，由天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁?動物合格證號為SCXK津2005-001)。

1.1.2 藥物 抵擋湯組成:桃仁10g，水蛭10g，虻蟲10g，大黃6g，購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，按傳統(tǒng)工藝制備水煎劑，減壓濃縮至濃度為1g/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

馬來酸羅格列酮(文迪雅)為葛蘭素史克公司生產(chǎn)(4mg/片，產(chǎn)品批號國藥準字H20020475)。阿托伐他丁鈣片為輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)(10mg/片，批號國藥準字J20070060)。

1.1.3 主要試劑 I抗MCP-1 IgG多克隆抗體:美國Abbiotec公司;I抗MIP-1αIgG多克隆抗體:美國SANT CRUZ公司;I抗E-選擇素IgG多克隆抗體:美國CST公司;SP免疫組化試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;大鼠血清可溶性E-選擇素EIA試劑盒:美國R＆D公司，博海生物試劑有限公司提供;全自動酶聯(lián)免疫分析儀:芬蘭Thermo Labsytoms公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 wistar大鼠140只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機抽取20只作為正常對照組(NC組)，給予標準飼料喂養(yǎng)，其余120只為造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，空腹眼眶采血測空腹血糖和胰島素計算胰島素敏感指數(shù)ISI=Ln【(FBG)(FINS)】-1，判斷動物出現(xiàn)胰島素抵抗后，隨機選取造模組20只大鼠分為中藥早期干預(yù)組(A)，按照人鼠等效劑量予抵當(dāng)湯生藥2.3g/(kg·d)灌胃，灌胃4周后開始造模。A組與造模組其他大鼠24h禁食不禁水，尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)30mg/kg(用前以PH4.2的0.1mol/L枸櫞酸緩沖液配成1%的濃度)。正常對照組僅注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液作為對照。3d后尾靜脈采血測血糖，隨機血糖高于16.7mmol/l確定造模成功。

NC組正常對照組(n=20只)，前期實驗已造模成功的110只大鼠，除A組中藥早期給藥組(n=18只)，其余大鼠按血糖、體重隨機分為B組中藥中期給藥組(n=18只)、C組中藥晚期給藥組(n=18只)、D組羅格列酮組(n=19只)、E組阿托伐他汀組(n=18只)、DM組糖尿病模型組(n=19只)4組，其中NC組為正常對照組。

1.2.2 實驗干預(yù) 所有給藥組均以體表面積折合成等效劑量給藥，A組中藥早期給藥組，造模4周前給藥，給予抵當(dāng)湯生藥2.3g/kg/d灌胃;B組中藥中期給藥組于成模后給予抵當(dāng)湯灌胃，劑量同A組;D組羅格列酮組和E組阿托伐他汀組成模后給藥，E組阿托伐他汀組的灌胃劑量為0.89mg/kg/d;D組羅格列酮組的灌胃劑量為0.36mg/kg/d，C組抵擋湯晚干預(yù)組于糖尿病模型成模后4周后給藥，給藥劑量同A組，均灌胃至造模后24周實驗結(jié)束取血取材。

1.2.3 指標檢測 大鼠隔夜禁食。內(nèi)眥靜脈采血10ml分離血清，－20℃保存?zhèn)錅y;戊巴比妥麻醉下取約1cm胸主動脈，固定、包埋、切片采用免疫組化檢測MCP-1、CD68及E-選擇素蛋白表達的表達，酶聯(lián)免疫法測試血清MCP-1、E-選擇素的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，各組之間比較用單因素方差分析(One way ANOVA)，2組之間比較采用t檢驗，方差不齊者用t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義，P＜0.01為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖的變化

表1顯示，模型組與正常組相較血糖明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)差異，提示造模成功。抵擋湯干預(yù)各組血糖無顯著差異(P＞0.05)。與模型對照組比較，抵擋湯早、中、晚期組和辛伐他汀組血糖差異性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示中藥和辛伐他汀無明顯降糖作用。與模型對照組比較，羅格列酮組血糖明顯降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血糖的變化(mmol/L)

表1 各組大鼠血糖的變化(mmol/L)

注:模型組與正常組比較:#P＜0.05，治療組與模型組比較:*P＜0.05

組別 給藥0周 給藥12周 給藥24周正 常 組5.34±1.24 5.96±1.31 5.85±1.08模 型 組 25.95±3.46# 28.33±4.36# 27.66±3.11#抵擋湯早期組 27.8±4.68 27.05±5.24 26.7±6.64抵擋湯中期組 27.29±6.62 25.38±8.25 26.12±8.25抵擋湯晚期組 28.15±5.57 24.46±5.1 25.48±6.23羅 格 列 酮 組 27.95±3.46* 14.95±3.58* 10.95±3.64*阿托伐他汀組28.02±2.65 27.29±6.62 26.12±8.25

2.2 抵擋湯早期干預(yù)對2型糖尿病胸主動脈CD68、MCP-1 E-選擇素的影響

表2顯示，糖尿病模型組與正常組比較，CD68、MCP-1、E-選擇素的表達均升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);除抵擋湯晚期給藥組外，各干預(yù)組與糖尿病模型組比較，CD68、MCP-1、E-選擇素均降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中藥早期給藥組與西藥組比較，CD68、MCP-1、E-選擇素的表達均降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，抵擋湯早期給藥組與抵擋湯中期給藥組比較無顯著差異。

2.3 抵擋湯早期干預(yù)對2型糖尿病大鼠血清MCP-1 E-選擇素的影響

表3顯示，模型組較正常組MCPI-1水平升高(P＜0.05)，抵擋湯早期干預(yù)組、抵擋湯中期干預(yù)組、阿托伐他汀鈣組較模型組血清MCP-1水平下調(diào)(P＜0.05)。模型組血清E-選擇素水平較正常組上升，抵擋湯早期干預(yù)組、阿托伐他汀鈣組較模型組表達水平下調(diào)(P＜0.05)。

表2 各組主動脈CD68、MCP-1、E-選擇素的表達水平

表2 各組主動脈CD68、MCP-1、E-選擇素的表達水平

注:模型組與正常組比較:#P＜0.05，治療組與模型組比較:*P＜0.05，羅格列酮、阿托伐他汀鈣組與抵擋湯早期治療組比較:▲P＜0.05

組別 CD68 MCP-1 E-選擇素正常對照組12.00±3.51 3.53±1.23 8.77±2.26糖 尿 病 模 型 25.00±2.07# 15.34±2.09# 31.00±8.22#抵擋湯早期 5.03±0.52* 3.23±0.66* 8.33±1.57*抵擋湯中期 5.67±0.43* 5.50±1.44* 9.67±1.40*抵 擋 湯 晚 期 23.00±5.00 10.67±1.24 31.67±1.62羅 格 列 酮 組 10.13±3.86＊▲ 6.67±4.04＊▲ 22.80±8.89＊▲阿托伐他汀組 13.33±3.20＊▲10.87±0.15＊▲ 23.71±6.96＊▲

表3 各組血清MCP-1、E-選擇素的表達水平(ng/ml)

表3 各組血清MCP-1、E-選擇素的表達水平(ng/ml)

注:模型組與正常組比較:#P＜0.05，治療組與模型組比較:*P＜0.05

組別 E-選擇素MCP-1正常對照組3.85±0.12 70.73±12.01糖尿病模型 10.24±0.46# 89.23±12.22#抵擋湯早期 3.59±0.22* 69.45±13.95*抵 擋 湯 中 期 4.990±0.19 73.27± 2.480*抵 擋 湯 晚 期 5.21±0.61 76.94± 8.57羅格列酮組 4.52±0.94 86.51±22.08阿托伐他汀組 3.77±0.11* 70.45±12.46*

3 討論

MCP-1屬于CC型趨化因子，是作用于單核細胞的特異趨化蛋白，是引起單核細胞趨化遷入血管內(nèi)膜下的主要趨化因子;病理條件下，動脈壁細胞(內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞)產(chǎn)生大量MCP-1，而MCP-l可刺激單核細胞分泌多種細胞因子[5];E-secletin表達于細胞因子活化的內(nèi)皮細胞表面，正常血管內(nèi)皮細胞不表達或低表達E-secletin，它的表達主要局限于受到炎性細胞因子刺激后活化的內(nèi)皮細胞，是介導(dǎo)白細胞與內(nèi)皮細胞黏附分子起始階段的重要因子，血清中sE-selectin的水平可反映血管內(nèi)皮細胞的激活狀態(tài)[6]。CD68是反應(yīng)單核/巨噬細胞的特異性抗原，均參與AS的發(fā)生并起到重要作用。本研究表明，抵擋湯干預(yù)后，主動脈CD68、MCP-1、E選擇素表達明顯下降，血清MCP-1、E選擇素也有不同程度下調(diào)，表明中藥抵擋湯具有一定的改善炎癥反應(yīng)的作用。

糖尿病大血管病變屬于中醫(yī)“消渴”變證，瘀血貫穿始終。近年來，DM的瘀血病機日益受到重視，認為瘀血為貫穿DM病程始終的重要病機。中醫(yī)學(xué)認為，糖尿病血管病變的發(fā)生是因消渴日久、氣陰兩虛，以致氣虛行血無力，陰虛脈道失濡而滯澀，終致瘀血阻滯脈道而成。因此，氣陰兩虛、瘀血阻滯是糖尿病血管病變發(fā)生、發(fā)展的基本病機?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，炎癥過程的中心環(huán)節(jié)是血管反應(yīng)。從傳統(tǒng)中醫(yī)理論看，低度的血管炎癥必然導(dǎo)致瘀血內(nèi)停。低度炎癥過程中，血管中和血管外多種有形成分的聚集，如血小板黏附、聚集及血栓形成單核細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，繼而在內(nèi)皮下沉積、結(jié)締組織形成、纖維斑塊、平滑肌細胞增生及免疫功能調(diào)節(jié)失常等均是中醫(yī)瘀血的具體表現(xiàn)[7]。抵擋湯是治療蓄血實證的經(jīng)典破血逐瘀名方，具有活血通絡(luò)、逐瘀攻下之功效。方中水蛭咸苦性平，入肝、膀胱二經(jīng)，專攻逐惡血瘀血、破血癥積聚;虻蟲破血逐瘀之力更峻;大黃蕩滌邪熱、導(dǎo)瘀下行;桃仁破血行血[8]。近來研究表明，本方對多種與血管性疾病相關(guān)的疑難疾病有較好的治療效果，并可改善血管內(nèi)皮功能。本研究則在前期臨床及實驗研究基礎(chǔ)上，進一步表明抵擋湯對糖尿病大鼠大血管病變具有獨立于降糖作用的干預(yù)作用。本實驗結(jié)果表明，抵擋湯早期干預(yù)，可能預(yù)防和延緩糖尿病大血管病變-AS的進展，為心腦血管疾病和周圍血管疾病級預(yù)防提供了有益的思路。

今后的研究中，我們將進一步開展系列研究，以期較深入地從炎癥角度探討中藥抵擋湯對糖尿病大血管病變的作用機制。

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