柴胡疏肝散對阿爾茨海默病大＊鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響

趙唯賢，李高申，薛紅莉，黃顯峰，裴 瑞，李寧寧，王 黎

(1.河南職工醫(yī)學(xué)院，鄭州 451191;2.黃河科技學(xué)院，鄭州 450006)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseas，AD)即老年性癡呆，是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口的老齡化，帶來了AD患病率的上升，對社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)，因此研究高效低毒的藥物防治AD，成為醫(yī)學(xué)科研人員的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。本課題通過觀察柴胡疏肝散對大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響，初步探討疏肝理氣方劑在AD治療中的意義，以期為篩選有效抗AD中藥提供新的探索方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級SD雄性健康大鼠(鼠齡5～6個(gè)月)48只，體重300g±20g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號SCXK(豫)2010-0002)。

1.2 藥物

1.2.1 制備 每日7∶00將柴胡疏肝散和腦力寶2組處方各稱取120g、90g分放入2只1000 mL瓷杯中，各加500 mL、400 mL純凈水浸泡30 min，放于煤氣爐上加蓋旺火加熱至水沸，改微火煎煮30 min，煎后的藥液過濾倒入另2只凈瓷杯中;重將煎后的藥物分別加水400 mL、300 mL，再次加蓋旺火煮沸，微火煎煮20 min，過濾倒出與第一次煎藥液混合，加熱濃縮藥液至規(guī)定濃度，分裝放至常溫備用。

1.2.2 組成及配比 柴胡疏肝散組成:柴胡、枳殼、白芍、陳皮、香附、川芎、甘草，各藥間質(zhì)量比2∶1.7∶1.7∶2∶1.7∶1.7∶1，柴胡疏肝散低、高劑量濃度分別為1.2 g·mL－1;腦力寶組成:遠(yuǎn)志、熟地、五味子、地骨皮、菟絲子、茯苓、石菖蒲、川芎，各藥間質(zhì)量等比，濃度為2 g·mL－1，均由我院科研科提供。

1.3 試劑儀器

D-半乳糖(D-gal，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，F(xiàn)20110318)，Aβ1～42(Sigma公司，A-1010)，2H-藍(lán)星B型腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn))。超薄切片機(jī)(型號LKBV)、透射電鏡(日本電子，JEM-1400)。

2 方法

2.1 分組

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組(A組)、生理鹽水組(B組)、模型組(C組)、疏肝低劑量組(D組)、疏肝高劑量組(E組)、補(bǔ)腎組(F組)共6組，每組8只。大鼠4只/籠，飼養(yǎng)于清潔級動(dòng)物房，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00～18∶00)，室內(nèi)溫度控制在22℃～24℃，相對濕度保持在30%～40%，自由飲食飲水。

2.2 模型制作

采用D-gal腹腔注射(ip)和Aβ雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造模[1]。(1)用生理鹽水將D-gal稀釋成10 g·L－1溶液，自造模第1天始每天上午9∶00～10∶00，對C、D、E、F各組大鼠ip1輪次，100 mg·kg－1;B組ip等體積的生理鹽水，各組共計(jì)ip42 d;(2)用無菌生理鹽水事先將Aβ1～42稀釋成10 g·L－1，在37℃溫箱中孵育7 d，使其變成為凝聚態(tài)的Aβ。自D-gal造模結(jié)束的次日，大鼠經(jīng)6%水合氯醛(0.6 g·kg－1)麻醉后，固定于腦立體定位儀上，常規(guī)消毒皮膚，正中矢狀切口，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)作為注射點(diǎn)，前囟向后3 mm，中線旁開2.2 mm處，分離骨膜，用牙科鉆鉆開顱骨暴露硬腦膜，微量注射器垂直進(jìn)針2.8 mm，將Aβ1～42溶液1μL緩慢注入，留針5 min保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，用滅菌醫(yī)用骨蠟填補(bǔ)骨孔，縫合切口，碘伏消毒，青霉素鈉注射每只8萬U預(yù)防感染，每日1次，連用3 d，常規(guī)飼養(yǎng);B組海馬注射等體積滅菌生理鹽水，方法同上。

2.3 藥物干預(yù)與劑量

A組、C組不進(jìn)行藥物干預(yù)，B組選用生理鹽水10 mL·kg－1，D組、E組分別選用低、高劑量的柴胡疏肝散10，20 g·kg－1(均為10 mL·kg－1)，F(xiàn)組選用腦力寶20 g·kg－1(10 mL·kg－1)，于Aβ造模后的第9天，每天上午9∶00各灌胃(ig)1輪次，連續(xù)進(jìn)行28 d。

2.4 水迷宮行為學(xué)檢測

各組分別自Aβ造模的第5天(ig干預(yù)前)和第37天(ig干預(yù)結(jié)束后的次日)各進(jìn)行水迷宮行為學(xué)檢測1輪(每天1次，連續(xù)3 d)，實(shí)驗(yàn)在每天上午9∶00進(jìn)行。方法:將大鼠自第Ⅰ～Ⅳ4個(gè)象限放入，分別記錄尋找安全平臺(tái)的時(shí)間，取各組大鼠各象限連續(xù)3 d測得時(shí)間的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 取材及觀察

在ig干預(yù)結(jié)束后的第4天，每組隨機(jī)選取3只大鼠6%水合氯醛行腹腔麻醉(0.6 g·kg－1)，打開胸腔，經(jīng)心尖部灌注預(yù)冷的生理鹽水400 ml，20 min左右灌流完畢，將灌注液改用4%多聚甲醛400 ml，灌注時(shí)間1.5 h內(nèi)。斷頭、組織鉗打開顱頂，剪開腦硬膜取出海馬，4%戊二醛固定2 h以上，4℃保存，常規(guī)制備，超薄切片機(jī)，Leica EMUC-7超薄切片，透射電鏡觀察CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 水迷宮成績

表1顯示，①僅造模手術(shù)對大鼠智力影響較小，灌胃刺激也不會(huì)給大鼠的記憶功能造成影響;②ig給藥前經(jīng)Aβ造模的C、D、E、F各組與空白組比較差異明顯(P＜0.05)，提示本次造模成功;③ig后E組和F組與同組ig前及與同期的模型組比較，均明顯縮短了迷宮尋找平臺(tái)時(shí)間(P＜0.01)，ig后D組與ig前及同期的模型組比較，迷宮尋找平臺(tái)時(shí)間變化不甚明顯。

表1 各組大鼠水迷宮尋找平臺(tái)時(shí)間的比較

表1 各組大鼠水迷宮尋找平臺(tái)時(shí)間的比較

注:與空白組比較:1)P＜0.01;與灌胃前及與同期模型組比較:2)P＜0.01;與疏肝低劑量組比較:3)P＜0.01(表3同)

組別 造模第5天(給藥前)造模第37天(給藥31 d后)空 白 組A 11.06±2.30 9.70±2.89生理鹽水組B 11.44±2.56 10.47±2.84模 型 組C 17.31±3.681) 17.41±2.931)疏肝低劑量組D 16.93±3.851) 14.52±2.81疏肝高劑量組E 17.34±3.351) 12.78±2.541，2)補(bǔ) 腎 組F 17.79±2.251) 14.11±2.661，2)

3.2 透射電鏡

空白和生理鹽水組，電鏡下可見海馬神經(jīng)突觸前后膜均一，厚度適中，突觸前膜內(nèi)的突觸小泡清晰可見，突觸間隙清晰;線粒體大小及形態(tài)正常，線粒體膜、脊完整，內(nèi)嵴清晰可見，基質(zhì)均勻(圖1、2)。模型組電鏡下神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)破壞，結(jié)構(gòu)紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數(shù)量減少;游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊(圖3)。疏肝低劑量組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，突觸前膜內(nèi)突觸小泡較清晰，突觸間隙清晰;線粒體膜基本完整，線粒體嵴較清晰(圖4)。疏肝高劑量組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，突觸前膜內(nèi)突觸小泡、突觸間隙清晰;線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見(圖5)。補(bǔ)腎組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，突觸膜增厚，突觸間隙清晰，突觸小泡數(shù)量基本正常，線粒體膜基本完整，線粒體嵴較清晰(圖6)。

圖1 空白組(30000×)

圖2 生理鹽水組(30000×)

圖3 模型組(30000×)

圖4 疏肝1組(30000×)

圖5 疏肝2組(50000×)

圖6 補(bǔ)腎組(30000×)

4 討論

AD患者的主要病理學(xué)特征是在腦中形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)和大量的老年斑以及彌漫性腦萎縮。由于神經(jīng)原纖維纏結(jié)的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau，而老年斑的主要成分是β淀粉樣多肽(Aβ)，因此，國外對AD研究的主流方向主要集中在tau和Aβ兩個(gè)方面[1]。

線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致AD能量代謝障礙的重要因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，線粒體損傷使Aβ的產(chǎn)生增加，又進(jìn)一步對線粒體產(chǎn)生損傷[2]，從而使神經(jīng)元退行性變化不斷加重。這可能是導(dǎo)致AD臨床癥狀不斷惡化的原因之一，保護(hù)或改善線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，將有利于AD癥狀的改善和恢復(fù)。

中醫(yī)認(rèn)為，肝主藏魂，魂是陽之精、氣之靈，魂與神有密切的聯(lián)系，對心理活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生較大影響。肝又主謀慮、主持思慮等思維活動(dòng)。清·陳士鐸指出:癡呆“大約其始也，起于肝氣之郁。”因此，理論上支持疏肝理氣法在改善記憶、認(rèn)知能力障礙上的治療作用，部分疏肝方劑的實(shí)驗(yàn)研究[3-5]也顯示了在調(diào)節(jié)記憶、認(rèn)知方面的作用。藥理研究表明，柴胡能改善腦細(xì)胞代謝和腦循環(huán)，延緩衰老引起的活性氧自由基的反應(yīng)速度，使衰老引起的神經(jīng)功能減退得到恢復(fù)[6]。白芍總苷能改善東莨菪堿誘發(fā)的小鼠空間識(shí)別障礙，對小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得不良有改善作用。當(dāng)歸可改善癡呆模型大鼠腦耗氧量和腦血流量，對腦缺血引起的空間認(rèn)知障礙有改善作用;并能增加絕經(jīng)大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)的煙堿性乙酰膽堿受體數(shù)目，提高膽堿乙酰化轉(zhuǎn)移酶的活性。茯苓含有增強(qiáng)脂質(zhì)代謝及各種酶的輔酶物質(zhì)，長期服用可使老齡大鼠內(nèi)在性膽堿和乙酰輔酶A的含量增加，有抑制抗膽堿的作用[7]。臨床研究也顯示，以疏肝解郁為主治療老年期癡呆病，除有助于改善患者的記憶力減退等癥狀外，還可顯著改善其情緒抑郁、反應(yīng)遲鈍的狀態(tài)，這對于減輕進(jìn)一步的智能損害、防止病情加重具有重要的臨床意義[8]。

本實(shí)驗(yàn)提示，經(jīng)柴胡疏肝散干預(yù)后的大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，突觸前膜內(nèi)突觸小泡清晰，突觸間隙清晰，線粒體膜完整，線粒體嵴清晰可見。對比模型組電鏡下神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)破壞明顯，結(jié)構(gòu)紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數(shù)量減少，游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊，解釋了變性突觸前膜和突觸后膜模糊不清，突觸間隙消失，直接導(dǎo)致神經(jīng)信號傳導(dǎo)障礙，使學(xué)習(xí)記憶能力下降。同時(shí)，柴胡疏肝散大劑量組經(jīng)灌胃干預(yù)后，大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間較灌胃前及同期模型組比較顯著縮短(P＜0.01)，其對大鼠記憶能力的提高不低于補(bǔ)腎組。印證了疏肝理氣方藥對記憶、認(rèn)知障礙的調(diào)節(jié)作用，充分顯示了以疏肝理氣立方在阿爾茨海默病治療中的意義。比較而言，柴胡疏肝散高劑量組較低劑量組作用優(yōu)勢明顯。

AD原因是復(fù)雜且漸進(jìn)的，應(yīng)從多方位、多靶點(diǎn)對本病從多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，期待有更多的實(shí)驗(yàn)研究為臨床用藥提供突破性的依據(jù)。

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