兩種多克隆刺激條件下人誘導性Treg表型的多樣性變化①

王海灝 仰霈雯 雷家慧 (華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院器官移植研究所教育部器官移植重點實驗室衛生部器官移植重點實驗室，武漢430030)

越來越多的研究表明，在人體內存在著一群具有免疫抑制功能的細胞，這些細胞在誘導移植免疫耐受、控制自身免疫性疾病和腫瘤免疫等方面發揮著重要的作用。因為這種特殊的細胞可以對免疫反應進行調節，所以顧名思義被稱為調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)［1-3］。目前已知，人 Treg 被區分為兩大類：即自然性調節性T細胞(natural Treg，nTreg)和誘導性調節性T細胞(induced Treg，iTreg)。有研究表明，nTreg在胸腺中產生，而iTreg則是在外周血或外周淋巴組織中，由原始T細胞(na ve T cells)受到自體或異體的抗原刺激而產生［4］。雖然，人nTreg和iTreg都具有免疫抑制功能，但iTreg在誘導移植物免疫耐受中的作用更重要。

1995 年，Sakaguchi等［5］率先報道了 CD4+CD25+T細胞具有免疫抑制功能;然而，隨著研究的深入，人和鼠的體內均發現活化的T細胞也表達CD25;進一步的研究發現，只有高表達 CD25(CD25high)的CD4+T細胞才能在體外發揮免疫抑制功能［6-8］。2003年，Sakaguchi研究組發現叉頭狀轉錄因子(Forkhead transcription factor，FoxP3)與Treg的發育及功能密切相關［9］。動物實驗的結果顯示FoxP3僅表達于Treg，而不表達于未激活的CD4+CD25-T 細胞或 Th1、Th2 等細胞中［9，10］，因此，直到現在CD4+CD25+FoxP3+都被公認為最具代表性的Treg的細胞表型。近年來，另一個人Treg的細胞標志物CD127-逐漸被人們所熟悉，IL-7受體CD127表達在細胞表面，并且與FoxP3呈明顯的負相關，Treg 不表達或弱表達 CD127［11］。

雖然iTreg的作用有細胞與細胞間接觸和分泌細胞因子兩種途徑，但是無論在體外還是體內實驗的結果都表明，分泌細胞因子的途徑是起主要作用的［12，13］。因此，除了上述的這些特異性細胞標志物外，一些非特異性的細胞因子也因為與iTreg的功能相關而被用于 iTreg的細胞表型中，如 IL-2-、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+等。

然而，在靜態條件下，T細胞并不或僅少量分泌產生細胞因子，為了研究細胞因子的變化，必須首先激活淋巴細胞。目前常用的淋巴細胞刺激劑為PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate，豆蔻酰佛波醇乙酯)和Ionomycin(離子霉素)，二者聯合使用被視為淋巴細胞最經典的多克隆刺激劑。然而，PMA/Ionomycin的刺激有一個無法回避的缺陷，即會顯著抑制CD4的表達，這一特點對實驗對象為CD4+T細胞的相關研究(如研究iTreg)將產生不利影響。近年來，其他的淋巴細胞刺激劑也陸續出現在相關報道中，如PHA(Phytohaemagglutinin，植物血凝素)等。本研究分別使用PMA/Ionomycin和PHA對人淋巴細胞進行刺激，檢測iTreg的誘導和細胞表型變化，分析其多樣性。本實驗在體外分離人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)后進行多克隆刺激，誘導產生iTreg，以四色流式細胞儀檢測其表達特異性/非特異性細胞標志物和相關細胞表型的變化。

1 材料與方法

1.1健康受試者 本實驗中每組實驗均選取5名健康受試者。本實驗實施前已經獲得本單位倫理委員會批準，并遵循《赫爾辛基宣言》的精神。所有健康受試者均被詳細告知本實驗的過程和目的，并簽署知情同意書。

1.2實驗分組 實驗依不同的實驗方法分為4組：①空白對照組：分離出PBMC后馬上染色檢測;②非刺激對照組：PBMC與細胞培養液RPMI1640(購自Invitrogen Gibco公司)培養16小時后檢測;③PMA/Ionomycin刺激組：將 PBMC與含 PMA/Ionomycin(購自Sigma公司)的培養液培養16小時后檢測;④PHA刺激組：將PBMC與含PHA(購自Remel公司)的培養液培養16小時后檢測。

1.3細胞制備、培養 用Ficoll梯度離心法從外周血(50 ml)中提取外周血單個核細胞(PBMC)。用含10%胎牛血清(FCS-500)的RPMI1640將試管中PBMC的濃度調整為1×106ml-1。空白對照組的PBMC馬上染色并上機檢測，其余各組則以1∶1的比例，將PBMC與10%RPMI1640細胞培養液(非刺激對照組)、含 PMA(10 ng/ml)/Ionomycin(1 μg/ml)的培養液(PMA/Ionomycin刺激組)或含PHA(180 μg/ml)的培養液(PHA刺激組)置于CO2培養箱中培養16小時。

1.4流式細胞計數檢測前準備 將培養后的PBMC從培養箱中取出，依分組移入準備好的試管，1 300 r/min離心8分鐘，棄上清。以10 μl PerCP-mouse-IgG1、20 μl FITC-mouse-IgG1、20 μl APC-mouse-IgG1以及 20 μl PE-rat-IgG1(均購自 BD公司)作為Isotype control;依實驗計劃，在試管中加入細胞表面抗體 CD4(PerCP，20 μl，BD)、CD25(APC，5 μl，BD)、CD127(FITC，5 μl，BD)，振蕩后室溫下避光培養15分鐘，加入2 ml緩沖液(DPBS，購自Invitrogen Gibco公司)，洗細胞(1 300 r/min轉速離心 8分鐘，棄上清)。加入 500 μl Perm2溶液(BD公司)作細胞透膜處理，振蕩后室溫下避光培養10分鐘。再加入2 ml DPBS洗細胞。加入胞內抗體 FoxP3(PE，20 μl，BD)、FoxP3(FITC，5 μl，eBioscience)、IFN-γ (FITC，10 μl，BD)、IL-2(FITC，10 μl，BD)、IL-10(PE，10 μl，BD)、TGF-β(PE，20 μl，R＆D)。振蕩后室溫下避光培養30分鐘，加入2 ml DPBS洗細胞;再加入2 ml DPBS，繼續培養30分鐘，洗細胞。以四色流式細胞儀(Flow Cytometry，Calibur，BD公司)檢測。

1.5流式檢測的設門策略 每支試管有至少100 000信號被記錄和分析。首先根據前向散射(FSC)和側向散射(SSC)設門選擇淋巴細胞群，然后再根據不同的實驗目的進行再次設門，如選擇CD4+CD25+PBL等。

1.6統計學分析 本實驗所有實驗數據用±s的形式表達，用 PASW Statisticc 18.0(IBM，Chicago，Illinois，USA)統計軟件進行方差分析，以P＜0.01為有明顯統計學差異。

2 結果

2.1PHA不抑制T細胞CD4的表達 圖1所示可見本實驗的設門策略。與非刺激組相比，PMA/Ionomycin刺激16小時后，CD4的表達明顯下降;同時，PHA刺激后，CD4的表達并不明顯減少。有意思的是，從圖1中還可以發現，PMA/Ionomycin和PHA的多克隆刺激后，CD3的表達均略有下降。可見，PMA/Ionomycin的刺激可以顯著抑制T細胞CD4分子的表達，而PHA并不抑制其表達。

2.2兩種多克隆刺激均可明顯誘導產生大量CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg 圖2所示，在從全血分離得到PBMC(空白對照組)中，CD4+CD25+FoxP3+CD127-占全部CD4+T細胞的比例僅為2.0% ±2.6%，即為nTreg的含量。在細胞培養液中培養16小時后，這一比例未見明顯變化(P=n.s.);用PMA/Ionomycin刺激 16小時后，CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg的表達升為26% ±19%(P＜0.01)，而用PHA刺激16小時后則上升為49% ±8.3%(P＜0.01)。實驗結果表明，細胞培養液并不能誘導產生CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg，而不論是PMA/Ionomycin還是PHA，均可以顯著誘導產生CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg。

圖1 設門策略及CD3和CD4分子在多克隆刺激下的表達Fig．1 Gating strategy and expressions of CD3 and CD4 during polyclonal stimulation

圖2 CD4+CD25+FoxP3+CD127－PBL在兩種多克隆刺激條件下的表達Fig．2 Expression of CD4+CD25+FoxP3+CD127－ PBL during polyclonal stimulation

2.3多克隆刺激對 IL-2-、IL-10+和 TGF-β+Treg的影響 多克隆刺激后CD4+CD25+FoxP3+IL-2-、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+和CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達上升，且 PHA對 IL-2-和TGF-β+iTreg的誘導比PMA/Ionomycin強。細胞培養16小時后，可以觀察到，在非刺激對照組中，CD4+CD25+FoxP3+IL-2-、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+和 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達與空白對照組中沒有明顯變化(16 h vs 0 h：P=n.s.，見表1～3)，而經過PMA/Ionomycin或PHA刺激16小時后，上述iTreg的表達明顯上升(均P＜0.01)，提示表達 IL-2-、IL-10+或 TGF-β+的 CD4+CD25+FoxP3+iTreg經多克隆刺激后可以明顯被誘導產生，卻不能被細胞培養液誘導。有意思的是，PHA刺激后CD4+CD25+FoxP3+IL-2-的比例較之PMA/Ionomycin刺激后有明顯的差異(42% vs 27%，P＜0.01，表1)，同樣的情況也可以在CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達上觀察到(33%vs 19%，P＜0.01，表2)，但 PHA 和 PMA/Ionomycin對CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg的刺激卻并沒有顯著的差異(26%vs 19%，P=n.s.，表3)，提示PMA/Ionomycin和 PHA雖然都可以產生 CD4+CD25+FoxP3+iTreg，但刺激的強度并不相同。

2.4PMA/Ionomycin可誘導CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+的表達升高 表4的結果顯示，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+在nTreg中比例極低，接近于零;經過16小時的刺激后，僅PMA/Ionomycin可以成功的誘導產生CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg(vs非刺激對照組：P＜0.01)，而PHA卻不行(vs非刺激對照組：P=n.s.，表4)，提示 PMA/Ionomycin和 PHA 的刺激途徑是不同的。

2.5PMA/Ionomycin刺激后，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的表達與CD25的水平呈負相關 在空白對照組和非刺激對照組中，無論CD25的表達高或低，都幾乎沒有 CD4+細胞表達 FoxP3+IFN-γ+;而經過 PMA/Ionomycin刺激16小時后，CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL的表達明顯上升(均P＜0.01)。有意思的是，將用PMA/Ionomycin刺激16小時后的PBMC根據CD25的表達水平來設門后發現，CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+的 表 達 高 于 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和 CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+的表達，即誘導產生的 CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL的表達與 CD25呈逆相關(圖3)，且 CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+的 表 達 水 平 與 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+、CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+相比均有顯著性差異(13% ±3.7% vs 3.4% ±2.4%，13% ±3.7%vs 1.4% ±2.0%，均P＜0.01)，但是 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+相比則無統計學差異(P=n.s.)，這個結果表明，在多克隆刺激后誘導產生的CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL中，真正具有免疫抑制功能的CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+iTreg只是很少一部分，這也反映了iTreg的多樣性變化。

表1 CD4+CD25+FoxP3+IL-2－iTreg的表達Tab．1 Expression of CD4+CD25+FoxP3+IL-2－ iTreg

表2 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達Tab．2 Expression of CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg

表3 CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg的表達Tab．3 Expression of CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg

表4 各組CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg占全部CD4+PBL的百分比Tab．4 Proportion of CD4+PBL expressing CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg

圖3 CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL與CD25的表達的關系Fig．3 Relationship between expression of CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL and CD25

3 討論

Treg(尤其是iTreg)的細胞表型多樣性研究一直是Treg相關研究的熱點。在各種文獻報道中，多種細胞標志物被用于表示iTreg的細胞表型，造成在對iTreg進行比較和研究時常常產生誤會。

本實驗，既關注于iTreg的特異性細胞標志物(CD25+、FoxP3+、CD127-)，又關注于非特異性細胞標志物(IL-2-、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+)，通過在體外實驗中多克隆刺激的方式，誘導產生不同細胞表型的iTreg，研究其刺激前后的變化。實驗中，對于全血進行淋巴細胞分離后馬上檢測的新鮮細胞(Fresh cells)的結果，可以反映血液中nTreg的狀況。通過實驗中可以看出，外周血中細胞表型為CD4+CD25+FoxP3+CD127-的 nTreg約占全部CD4+T細胞的4%左右，這部分nTreg細胞在維持自身的免疫穩態中發揮著重要的作用。而非特異性細胞標志物在nTreg中的表達同樣非常低，這是因為在靜止狀態下，機體不分泌或僅分泌少量的細胞因子。只有在細胞活化的時候，細胞內合成細胞因子才會增加。要研究細胞因子的變化，必須使用淋巴細胞刺激劑使之活化。

目前最常用的淋巴細胞刺激劑是PMA/Ionomycin和PHA兩種。本實驗研究和比較了兩種激活劑對iTreg的刺激效果，為選擇合適的實驗劑量，在課題預實驗中，我們比較了 PMA(5、10、20 ng/ml)/Ionomycin(0.5、1、2 μg/ml) 和 PHA(90、180、270 μg/ml)等多個劑量對 T 細胞 CD4、CD8、CD25、IL-10、TGF-β、IFN-γ的刺激效果，各濃度間無明顯差異(P=n.s.，具體數據未顯示)，均可視為對淋巴細胞充分刺激。

本實驗結果顯示，PMA/Ionomycin和PHA均可以有效的刺激靜止的淋巴細胞活化，并誘導產生iTreg。值得注意的是，這二者刺激的效果并不一樣，對表達 IFN-γ的 Treg誘導過程中可以發現，PMA/Ionomycin可以有效的刺激產生CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg，而PHA則不能誘導產生;而對于表達IL-2-和TGF-β+的Treg的誘導過程中可以看到，PMA/Ionomycin和PHA對iTreg的刺激力度是不一樣的，提示PMA/Ionomycin和PHA對淋巴細胞的刺激有不同的作用途徑。另外，以PMA/Ionomycin作為激活劑對淋巴細胞進行刺激會顯著降低CD4分子的表達(本實驗中，刺激前54%的CD3+T細胞表達CD4+，而刺激后僅16%，具體數據未顯示)，這嚴重影響到后續實驗中以CD4+細胞設門分析iTreg的表達。因此，有報道指出，可以用CD3+CD8-T細胞設門來代替 CD3+CD4+T 細胞［14］;但是，我們在以非CD4組合抗體(Cocktail sets)和CD8抗體進行比較后發現，PMA/Ionomycin刺激后的淋巴細胞表達CD3+CD4-的細胞并非全部表達CD3+CD8+(具體數據未顯示)，即CD3+CD8-T細胞也并不能代替CD3+CD4+T細胞，它還包括有自然殺傷細胞(NK細胞)和部分CD3+CD8-CD4-細胞。有意思的是，雖然PMA/Ionomycin刺激后會降低CD4+的表達，但是刺激后CD4+iTreg的表達卻明顯升高，各種特異性和非特異性的細胞標志物均明顯升高。同時，對于本實驗所觀測幾項指標，除了CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg外，其余的細胞標志物在受到PHA的刺激后升高的程度比PMA/Ionomycin更高，這為進一步的分選擇iTreg或功能實驗提供了一種新的選擇。另外，經過PMA/Ionomycin或PHA刺激后，流式細胞檢測時會發現PBMC與刺激前出現了明顯的變化，表現為淋巴細胞群與單核細胞群出現明顯的重疊，并由于染色過程中破膜，使得細胞變小、顆粒減少，在FSC-SSC散點圖上表現為細胞群向左下移動、聚集，而不易圈出明顯的淋巴細胞群。

在所有細胞因子中，分泌IL-10、TGF-β及缺乏IL-2一直被公認為是與iTreg的發育和功能密切相關，本實驗也觀測到 CD4+CD25+FoxP3+IL-2-iTreg、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg 和 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg在受到刺激后表達明顯升高。IFN-γ是一類比較特殊的細胞因子。雖然幾乎所有的淋巴細胞都可以產生IFN-α和IFN-β，但是只是活化T細胞和NK細胞才能產生IFN-γ。以前，IFN-γ被認為是Th1細胞的標志性細胞因子，但是后來又發現Treg和CD8+T細胞同樣可以產生IFN-γ，且IFN-γ在抗炎癥、抗腫瘤和免疫調節方面發揮著重要的作用。

近來，德國Daniel研究組(筆者作為主要研究者參與其中)陸續報道，表達IFN-γ的CD4+iTreg和腎移植術后患者移植腎功能長期存活密切相關。在對腎移植術后患者的長期隨訪監測中發現，與移植腎功能受損的患者相比，移植物功能良好的患者體內表達 IFN-γ的 CD4+Treg(CD3+CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+)數量明顯升高，提示 IFN-γ 也許在誘導人移植物免疫耐受中發揮著重要的作用，并認為CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的免疫抑制功能可能是IFN-γ依賴性的［15-17］。本實驗觀察到，雖然PMA/Ionomycin刺激后，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的表達會明顯升高，但是其表達水平與CD25的水平呈逆相關，雖然 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和 CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+的水平無明顯差異，但是隨著CD25水平的升高，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg占所有CD4+T細胞的百分比越低，這也許表明真正具有免疫抑制功能的CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg在外周血中含量極低。值得探討的是，雖然也有文獻報道刺激后的CD4+CD25-T細胞表達FoxP3+，且同樣會產生活化的細胞因子［18］，但本實驗中觀察到的部分細胞刺激后表達為 CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+，是否全部為誘導性的CD4+CD25-T細胞，是否包括部分的自然殺傷T細胞(NKT細胞)，這些都值得進一步的深入研究。

綜上所述，本實驗通過使用PMA/Ionomycin和PHA對人PBMC進行多克隆刺激后可以誘導產生iTreg。不同細胞表型的iTreg反映了人調節性T細胞的多樣性變化，同時細胞表型中表達或不表達的細胞因子與iTreg的作用機制可能密切相關;實驗中同時發現PMA/Ionomycin和PHA對人iTreg誘導的機制和程度不一樣。這些實驗結果將有利于進一步開展人iTreg的功能實驗，并最終將人iTreg的實驗成果應用于臨床的診斷和治療實踐中。

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