ODDD乏氧靶向HSV1-TK/GCV系統對體外肝癌細胞的殺傷作用①

方艷秋 劉 磊 譚 巖 蔣永興 (吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春130021)

靶向基因治療被認為是一種有效的肝癌治療研究手段［1］。瘤體組織內的乏氧改變，為肝癌基因治療提供了理想靶點。位于HIF-1α(Hypoxia inducible factor-1 alpha)分子中有一段含有200多個氨基酸殘基的氧依賴降解結構域(Oxygen dependent degradation domain，ODDD)可以有效的感受組織環境中的氧含量，調控與之相連的蛋白乏氧靶向性特異表達［2］。本實驗將構建含有ODDD序列的單純皰疹病毒胸苷激酶(Herpeslsimplex virus-thymidine kinase，HSV1-TK)自殺基因表達載體，體外研究其對肝癌細胞株SMMC7721和HepG2的殺傷作用，探討ODDD調控HSV1-TK基因乏氧靶向治療肝癌的可行性。

1 材料與方法

1.1儀器和實驗材料 肝癌細胞株SMMC7721、HepG2由本實驗室傳代培養;質粒pEGFP-ODDD為本實驗室構建并保存。攜帶HSV1-TK的質粒pHSV106為Gibco/BRL公司產品。二甲亞砜(DMSO)為Sigma公司產品;噻唑藍(MTT液)為Sigma公司產品。250 mg MTT溶于50 ml PBS(0.01 mol/L，pH7.4)中，0.22 μm微孔濾器除菌，分裝，4℃保存。更昔洛韋(GCV)，分子量為255，美國 Sigma公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1pEGFP-TK和pEGFP-TK-ODDD表達載體的構建 參照本研究組前期工作［3］。

1.2.2質粒轉染SMMC7721細胞和HepG2細胞

將處于對數生長期的SMMC7721細胞和HepG2細胞分別接種于24孔板，接種數量為5×104/孔，37℃，5%CO2培養箱中培養24小時。24小時后待細胞90%融合時用LipofectamineTM2000分別轉染pEGFP-TK和pEGFP-TK-ODDD質粒。流式細胞儀檢測轉染質粒細胞48小時EGFP表達強度。

1.2.3MTT法檢測HSV1-TK/GCV系統對肝癌細胞的體外殺傷效應 細胞轉染后4小時將培養液換為含10%血清的IMDM培養液。細胞分為6組：A.常氧未轉染組;B.常氧轉染pEGFP-TK組;C.常氧轉染pEGFP-TK-ODDD組;D.乏氧未轉染組;E.乏氧轉染pEGFP-TK組;F.乏氧轉染pEGFP-TK-ODDD組。與實驗各組平行設立只加培養液不加細胞作為空白對照，每組又分為不同GCV濃度亞組(mg/L)：0、12.5、25、50、100、200 和 400。更換培養液后 D 組、F組、E組放入乏氧環境中(三氣培養箱含1%O2，5%CO2和N2平衡氣)。細胞繼續培養24小時后將原培養液棄去，加入含有不同濃度GCV的完全培養液，每個濃度設3個復孔，以不加GCV的細胞作為陰性對照。24小時后換為不含GCV的完全培養液。繼續培養 24 小時后加入 200 μl/孔 MTT 液(300 μl/ml)，溫浴4小時后，棄上清，每孔加入DMSO 200 μl，作用30分鐘并輕微振蕩后，使結晶物充分溶解。將100 μl上清液加入到96孔培養板中，空白對照調零，于波長540 nm酶標儀檢測吸光度值(A值)。細胞存活率(%)=(處理組平均A值/陰性對照組A值)×100%。上述實驗重復3次。

1.3統計學分析 統計學分析的計量資料數據以±s表示，兩組間參數比較采用t檢驗，多組間數據采用方差分析，采用SPSS10.0統計軟件包進行統計處理。

2 結果

2.1自殺基因載體細胞轉染效率 1 μl Lipofectam ineTM2000分別和4 μg pEGFP-TK-ODDD質粒混合后轉染SMMC7721和HepG2細胞48小時后，流式細胞術檢測 EGFP表達。結果顯示：根據對SMMC7721細胞和HepG2細胞EGFP表達量分析，細胞pEGFP-TK質粒轉染率分別為33.23%和36.97%，見圖1。

2.2腫瘤細胞對前體藥物GCV敏感性 應用不同濃度GCV加入培養相同細胞數目的未轉染的SMMC7721和 HepG2細胞作用24小時后，經過MTT方法檢測，SMMC7721和HepG2細胞在常氧及乏氧環境下各組吸光值(如表1)。應用公式計算獲得細胞的生存率，發現在GCV＜50 mg/L時，GCV對未轉染細胞無殺傷作用，不會產生對系統的毒性作用。隨著GCV濃度增大，細胞存活率逐漸下降，GCV＞100 mg/L時，GCV對細胞有毒性作用(P＜0.05)，這種毒性作用與環境中的氧濃度無關。

圖1 流式細胞術檢測質粒pEGFP-TK細胞轉染效率Fig．1 Flow cytometric analysis for transfection rate of pEGFP-TK in cells

表1 GCV對腫瘤細胞增殖的影響(n=3)Tab．1 The sensitivity of cells to GCV(n=3)

圖2 HSV1-TK/GCV對轉染質粒pEGFP-TK細胞的殺傷作用(n=3)Fig．2 The effect of GCV on growth of SMMC7721 cells and HepG2 cells transfected by the plasmid of pEGFP-TK(n=3)

2.3GCV對轉染pEGFP-TK質粒腫瘤細胞的體外殺傷效應 轉染pEGFP-TK質粒后，隨著GCV濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，細胞對GCV的敏感性呈劑量依賴性(P＜0.05，圖2)。在相同GCV濃度，乏氧時轉染細胞存活率高于常氧時轉染細胞存活率，但無統計學差異(P＞0.05)，提示乏氧可能降低腫瘤細胞對GCV代謝物的敏感性，但對于HSV1-TK/GCV對腫瘤的殺傷作用影響不顯著。

2.4ODDD調節HSV1-TK/GCV對乏氧腫瘤細胞的靶向性殺傷作用 GCV處理轉染pEGFP-TKODDD細胞24小時后，無論是SMMC7721細胞還是HepG2細胞，乏氧組細胞存活率較常氧組對照均顯著下降，統計學處理有顯著性差異，各組均P＜0.05(圖3)。提示ODDD結構域能感受細胞內氧濃度的變化，正常氧環境下使TK蛋白降解，從而減少對GCV的催化作用，降低了對腫瘤細胞的殺傷作用;而在乏氧組，TK蛋白可以穩定存在發揮生物活性，最終導致腫瘤細胞存活率隨著GCV濃度的升高而逐漸降低。

3 討論

乏氧是實體腫瘤發展過程中的普遍現象，影響腫瘤細胞的很多基因轉錄活性發生改變。肝癌細胞組織內缺氧尤為顯著，肝內正常的血供系統的破壞和肝臟腫瘤細胞的高度增殖是引起肝癌組織內嚴重缺氧的重要原因［4］。肝癌微環境的乏氧是導致肝癌化療耐藥的重要原因，多年來人們一直在研究克服腫瘤乏氧的方法，各種療法雖然在不同程度上改善了腫瘤的乏氧現象，但都未能在臨床中得到廣泛的應用。基因治療被認為是最有前景的腫瘤治療方法，從1989年開始應用于臨床至今已經有超過200多個有關腫瘤基因治療的臨床試驗［5］。靶向性一直是基因治療領域研究的重點和難點，載體的不專一不但降低了靶基因對腫瘤細胞的殺傷效應，同時還可能會誤殺非靶器官或腫瘤以外部位，造成副作用［6］。

圖3 GCV對轉染pEGFP-TK-ODDD質粒腫瘤細胞增殖的影響(n=3)Fig．3 The effect of GCV on growth of SMMC7721 cells and HepG2 cells transfected by the plasmid of pEGFP-TK-ODDD(n=3)

以HSV1-TK/GCV系統為代表的自殺基因療法可以實現選擇性原位轉導和特異性殺傷的優點，從而使其較早獲得美國國立衛生研究院(NIH)和重組DNA顧問委員會(RAC)的批準而應用于臨床［6］。本研究選用了兩種研究中比較常見的肝癌細胞株SMMC7721和HepG2作為靶細胞來探討HSV1-TK/GCV系統對腫瘤細胞的殺傷作用。結果顯示，在轉染效率基本相同的情況下，GCV濃度為12.5 mg/L時，轉染 pEGFP-TK質粒的 SMMC7721細胞和HepG2細胞的存活率為64.21%和57.41%，均低于未轉染腫瘤細胞的存活率，說明轉染了pEGFP-TK質粒的細胞能夠有效的將前體藥物GCV轉換為對細胞有毒性的藥物，發揮對肝癌細胞株SMMC7721和HepG2的殺傷作用，HSV1-TK/GCV系統對腫瘤的殺傷作用具有普遍性。

目前限制自殺基因療法臨床應用主要原因之一是高劑量的GCV對機體可能產生嚴重的毒副反應。研究發現GCV濃度大于1 mmol/L即可產生對細胞毒性作用［7］。本研究也證實，在乏氧及正常氧環境下，低濃度GCV(＜50 mg/L)對SMMC7721細胞和HepG2細胞的存活率無明顯影響，細胞存活率幾乎為100%;隨著GCV濃度增大，細胞存活率下降，在GCV濃度400 mg/L時，細胞的存活率降到70%左右(SMMC7721細胞和HepG2細胞的存活率分別68.46%和71.35%)，說明高濃度GCV(＞100 mg/L)時在常氧和乏氧環境下均可以產生對細胞的毒性作用，可能會在臨床應用中產生對系統的非靶向性傷害。

以乏氧為靶點的腫瘤基因療法被證實可以有效的發揮殺傷腫瘤的同時，還可以顯著的降低基因疫苗對機體的損傷毒性作用［8，9］。ODDD是調控HIF-1α分子在乏氧環境中特異性發揮生物學活性的重要結構域，研究進一步證實含有ODDD結構域的重組蛋白可以在乏氧環境下特異的表達并發揮生物學效應［10］。本研究的目的就是將ODDD結構域對乏氧的特異性應答效應應用到調控HSV1-TK/GCV系統中，利用腫瘤乏氧的特異性病理改變使TK基因在腫瘤細胞中特異表達，靶向殺傷肝癌細胞。實驗結果顯示，轉染含有相同濃度GCV作用后，乏氧環境下SMMC7721細胞和HepG2細胞的存活率顯著低于正常氧環境中的腫瘤細胞(見結果2.4，P＜0.05)。提示乏氧環境下細胞中的HSV1-TK基因可以穩定表達發揮對前體藥物GCV的催化作用，使其轉化為對腫瘤細胞有殺傷作用的藥物。而在正常氧環境下，ODDD可以感應細胞內氧水平，誘導HSV1-TK蛋白特異性的降解，使其不能有效發揮其生物效應，ODDD介導的自殺基因靶向性殺傷研究為肝癌的基因治療研究提供了新的研究方法。

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