Sirt1去乙酰化酶抑制劑誘導成人白血病細胞系MT2生長阻滯及凋亡①

朱小飛 郭曉芳 孫瑞利 高志濤 馬淑君 張婧婧 王 輝

(新鄉醫學院醫學檢驗系，新鄉453003)

成人 T細胞白血病(Adult T-cell leukemia，ATL)是一種由人T細胞白血病病毒Ⅰ(HTLV-Ⅰ)感染引起的、發生于成人的特殊類型淋巴系統惡性克隆增殖性疾病，其致病特點主要是引起外周血CD4+T淋巴細胞異常增殖及惡性轉化。雖然該疾病致病原因已經明確，但迄今對ATL的詳細發病分子機制尚未最終闡明，臨床傳統化療對于該疾病治療收效甚微［1］。近期研究發現，Sirt1去乙酰化酶的高水平表達與B淋巴細胞瘤、ATL等多種血液系統惡性腫瘤的異常增殖存活有著密切關系，提示Sirt1可能是這些惡性腫瘤細胞抗凋亡的一個關鍵分子;在Burkitt淋巴瘤的動物實驗中也顯示Sirt1抑制劑確能有效抑制腫瘤增殖［2，3］。然而，有報道發現在HIV感染的異常增殖T淋巴細胞中，病毒蛋白Tat抑制了Sirt1的活性，卻有助于T細胞高度活化及促進HIV轉錄［4］。而且目前Sirt1抑制劑在抗成人T細胞白血病方面的研究還是較少。因此，為探討Sirt1去乙酰化酶活性與成人白血病細胞系MT2異常增殖之間的關系，我們通過Sirt1抑制劑尼克酰胺(Nicotinamide)，采用MTT、流式細胞術等檢測方法，評價了抑制Sirt1去乙酰化酶活性對成人白血病細胞系MT2存活的影響，以期為ATL的臨床治療提供一定的實驗參考。

1 材料與方法

1.1材料 RNA抽提試劑、細胞凋亡檢測試劑盒、碘化丙啶試劑購自江蘇碧云天生物技術研究所，逆轉錄酶 PrimeScript?Reverse Transcriptase、Taq酶試劑、Oligo(dT)18引物購自大連寶生物工程有限公司，Sirt1引物由上海生工合成，Nicotinamide購自北京鼎國生物技術公司，Jurkat、MOLT-4和MT2細胞株由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1細胞培養 Jurkat，MOLT-4和MT2細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養基，置于37°C、含5%CO2的細胞孵育箱中培養。

1.2.2細胞形態觀察 取對數生長期MT2細胞，接種6孔板，培養24小時后，加入40 mmol/L Nicotinamide處理24小時(培養液配制)，對照組加入未加藥的培養液，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。1.2.3RT-PCR檢測細胞Sirt1水平 取對數生長期的Jurkat、MOLT-4和MT2細胞進行總RNA提取以及第一鏈cDNA合成，操作方法參照試劑說明書。然后通過PCR法檢測Sirt1和GAPDH的mRNA表達，引物見表1，退火溫度為60℃。電泳圖片用ImageJ 1.44p進行灰度分析，目的基因的表達量是以目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值來反映。

1.2.4MTT法檢測MT2細胞活力 將對數生長期的MT2細胞，用RPMI1640完全培養基稀釋至一定濃度的細胞懸液，按5 000/孔的細胞濃度接種96孔板，置于二氧化碳培養箱培養24小時;接著加入不同濃度的Nicotinamide處理48小時;具體操作參照文獻報道的改良MTT法進行細胞活力的檢測［5］。

表1 擴增目的基因的引物序列Tab．1 The primer of PCR for detecting target gene transcripts

1.2.5流式細胞法分析MT2細胞周期 取對數生長期MT2細胞，接種6孔板，培養24小時后，加入不同濃度Nicotinamide處理24小時，離心收集細胞后，PBS洗滌2次，75%乙醇4℃固定細胞過夜。上機前離心去除乙醇，用PBS洗2次，細胞重懸于500 μl預冷PBS緩沖液中，加入50 μl RNase(1 mg/ml)和25 μl PI(1 mg/ml)，室溫避光孵育30分鐘，上機檢測細胞周期。

1.2.6流式細胞法分析MT2細胞凋亡 取對數生長期MT2細胞，接種6孔板，培養24小時后，加入40 mmol/L Nicotinamide處理24小時，離心收集細胞后，PBS洗滌2次，染色步驟按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。上機前用300目網篩過濾后進行檢測。

2 結果

2.1三種白血病細胞系Sirt1表達水平比較 我們通過RT-PCR檢測了Jurkat、MOLT-4和MT2三種T淋巴細胞白血病細胞系中Sirt1的mRNA水平，發現這三種細胞系中MT2細胞的Sirt1表達量最高，是Jurkat細胞的1.2倍(P＜0.05);其次為MOLT-4細胞系，但MOLT-4細胞的Sirt1表達量與其他兩種細胞比較，無統計學意義(圖1)。

2.2Nicotinamide抑制MT2細胞增殖 針對MT2細胞中高水平表達的Sirt1，我們通過Nicotinamide處理細胞，觀察抑制Sirt1酶活性對MT2細胞增殖是否有影響。結果顯示Nicotinamide能明顯抑制MT2細胞的生長增殖，而且呈現一定的劑量依賴關系(圖 2);與對照相比，5、10、20 和 40 mmol/L Nicotinamide的細胞增殖抑制率分別為(15.4±3.8)%、(27.7±2.8)%、(49.1±9.6)%和(67.5±3.3)%。

圖1 T細胞白血病細胞系中Sirt1 mRNA水平分析Fig．1 The levels of Sirt1 mRNA in T-cell leukemia cell lines

2.3Nicotinamide引起MT2細胞周期阻滯 依據Nicotinamide抑制MT2細胞增殖的結果，我們進一步分析該Sirt1抑制劑對MT2細胞周期的影響。流式實驗結果顯示，40 mmol/L Nicotinamide能引起MT2細胞出現明顯G2/M期阻滯，與未處理組［G2/M期(18.56±4.3)%;S期(33.54±3.8)%］比較，40 mmol/L Nicotinamide處理組G2/M期細胞百分率。增加到(46.02±5.5)%，S期細胞百分率降低到(10.94±3.5)%;然而，20 mmol/L Nicotinamide處理組G2/M期和S期細胞百分率變化不明顯(圖3)。

2.4Nicotinamide誘導MT2細胞凋亡 根據細胞周期實驗結果，我們通過流式技術同時分析了Nicotinamide對MT2細胞凋亡的影響。40 mmol/L Nicotinamide處理 MT2細胞24小時后，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡的百分比，結果顯示，與未處理對照組比較，細胞總凋亡率增加了2.4倍，大部分細胞凋亡表現為晚期凋亡(圖4)。同時，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化，發現細胞體積縮小，細胞膜出現皺縮、卷曲及破裂;胞漿顆粒增多，細胞折光性減弱等凋亡樣變化(圖5)。

圖2 MTT法分析尼克酰胺對MT2細胞增殖活力影響Fig．2 The cell viability of MT2 by MTT assay after Nicotinamide(Nam)treatment

圖3 尼克酰胺對MT2細胞周期影響Fig．3 The arrest of cell cycle after Nicotinamide(Nam)treatment in MT2 cells

圖4 尼克酰胺對MT2細胞的細胞凋亡分析Fig．4 Cell apoptosis after Nicotinamide(Nam)treatment in MT2 cells

圖5 尼克酰胺對MT2細胞形態學變化的影響Fig．5 The changes of cell morphology in MT2 cells after Nicotinamide(Nam)treatment

3 討論

成人T細胞白血病(ATL)雖然在我國比較少見，但鄰國日本是HTLV-Ⅰ感染及相關疾病的高發區;同時近幾年大量流行病學調查顯示，我國局部地區，尤其是福建、廣東東南沿海地區以及東三省東南地區存在小范圍的HTLV-Ⅰ感染流行，相比以前，已有擴大趨勢，因此，對HTLV-Ⅰ感染相關疾病ATL的研究有助于我們更好預防該疾病的發生及發展［6，7］。臨床研究顯示，成人 T 細胞白血病(ATL)的患者中，65%的患者是以急性發病形式存在，即使先進的化療和支持療法，患者的平均生存周期仍只在6個月～1年左右。迄今為止，除了骨髓移植外，臨床仍無有效的藥物能明顯改善患者的生存期。患者體內感染HTLV-Ⅰ的T細胞持續異常增殖及惡性轉化，繼而引起機體免疫缺陷是導致ATL患者死亡的主要原因之一。目前對于ATL的分子機制仍不十分清楚，但是減少或殺死惡性轉化的白血病T細胞仍是臨床 ATL 的治療策略之一［8，9］。

在惡性血液腫瘤治療中，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)展示出較好的抗癌效果，如Vorinostat(SAHA)已被美國FDA批準為治療皮膚T細胞淋巴瘤的臨床用藥［10］。但是，在實際臨床應用中HDACi有時卻達不到預期效果。有研究認為可能是目前應的HDACi，大多數是針對的靶標都是組蛋白去乙酰化酶家族的Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類成員，而對于Ⅲ類家族成員Sirtuins卻無抑制作用。

Sirtuins去乙酰化酶蛋白家族是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙酰化酶，其家族中的Sirt1去乙酰化酶在腫瘤的發生發展及耐藥性中擔當重要的角色。它在多種惡性腫瘤中高水平的表達，通過去乙酰化多種蛋白底物來阻斷細胞衰老及凋亡，促進細胞增殖存活［11-13］。然而，目前Sirt1抑制劑用于白血病防治及應用研究還處于初步階段。研究顯示，對于高水平表達Sirt1的淋巴細胞腫瘤，Sirt1 抑制劑可能是有效治療靶標［14，15］。

最近 Kozako等［15］研究發現，在 HTLV-Ⅰ感染的細胞，Sirt1也呈高水平表達，提出了以Sirt1為新靶標的抗ATL治療新策略。而且，有報道HDACi與Sirt1抑制劑聯合應用顯示出協同的抗白血病效果［14］。因此，為了闡明Sirt1在ATL發生發展中的作用，我們以Sirt1的天然抑制劑尼克酰胺(Nicotinamide)為研究材料，以ATL細胞系MT2為研究對象，研究了Nicotinamide對成人白血病細胞系MT2增殖及存活的影響。通過半定量PCR實驗，我們發現在MT2細胞中Sirt1表達水平明顯高于Jurkat淋巴瘤細胞，這與Kozako等人的報道一致［15］。在此基礎上，我們通過Sirt1抑制劑Nicotinamide對MT2細胞進行處理，MTT實驗結果顯示Nicotinamide對MT2細胞具有生長抑制作用，而且這種生長抑制作用是具有藥物劑量依賴性。先前多項研究證實Sirt1去乙酰化酶的抗凋亡作用，是通過對其蛋白底物的去乙酰化作用來實現的，如 p53、Foxo、Ku70。這些蛋白都是細胞凋亡途徑中重要的轉錄調控因子;當乙酰化水平降低，它們促凋亡的轉錄調節活性明顯失活;當抑制住Sirt1的去乙酰化活性，高度乙酰化狀態增強了其促凋亡的轉錄調節活性，通過其介導的信號途徑，最終導致細胞周期阻滯或者細胞凋亡［13，16］。鑒于Sirt1在細胞抗凋亡中重要生物學作用，結合實驗數據，我們推測Sirt1去乙酰化酶與MT2細胞異常增殖至少存在一定的正相關性。我們的實驗也證實，Nicotinamide能明顯阻滯MT2細胞周期于G2/M期，以及誘導細胞凋亡。與對照組比較［凋亡百分率(4.91±0.58)%］，Nicotinamide處理組凋亡率達到(12.78±0.87)%。然而，我們實驗顯示Nicotinamide處理后MT2細胞Sirt1表達水平的變化并未受到影響，因此我們推測其分子機制可能與抑制Sirt1的去乙酰化活性有關，從而影響到其下游凋亡信號通路。詳盡的分子機制我們正在研究之中。

綜上所述，我們實驗表明了Sirt1抑制劑能抑制ATL細胞系MT2生長增殖，誘導細胞周期阻滯及凋亡，為以Sirt1為新靶標的抗ATL治療新策略提供進一步印證。但是目前許多細胞研究對Sirt1在淋巴細胞腫瘤中擔當的角色仍存在爭議，有人認為Sirt1在T細胞的激活增殖中起到負調控的作用［4，17］。因此，需要進一步去研究Sirt1對ATL的T細胞持續異常增殖及惡性轉化的詳細分子機制，才有助于Sirt1抑制劑更好的運用于臨床ATL的治療。

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