LPS誘發sAPP-α轉基因鼠神經細胞損傷機制的初步探討

王 政 韓玉霞 蘇 剛 陳迪祥 肖元宏 (中國人民解放軍總醫院小兒外科，北京100853)

小兒孤獨癥(Autism)，又稱小兒自閉癥，是一類以嚴重孤獨、缺乏情感反應、語言發育障礙、刻板重復動作和對環境奇特反應為特征的疾病，在美國的發病率為萬分之14.9。根據全世界的統計，小兒孤獨癥的發病率大約為萬分之五，以中國目前現有的總人口數量來估計，有五十萬左右的孤獨癥患者［1］。目前，對小兒孤獨癥并無特效治療，因此對于發病機制的研究，將為該病的有效治療提供理論依據。

小兒孤獨癥的發病機制非常復雜：大量資料提示本病與遺傳有關;也有研究發現與大腦器質性損害有關;還有研究者認為疫苗免疫所引發的免疫損傷是造小兒孤獨癥發病的元兇。Sokol和他的同事研究發現，孤獨癥患兒體內sAPP-α含量是正常兒童的兩倍，推測淀粉樣前蛋白(Amyloid precursor protein，APP)在孤獨癥患兒體內更多以α切割形成sAPP-α為主，而非傳統上 β、γ切割形成Aβ肽段(Amyloid beta)［2］。

sAPP-α轉基因小鼠體內過表達 sAPP-α，模擬一種基因突變可能導致的小兒孤獨癥。對該小鼠的行為學、癥狀學分析表明，該小鼠模型在正常狀態下并不會自動發展為孤獨癥。本研究使用格蘭陰性細菌的主要毒力因子LPS感染小鼠，驗證感染是否是促進該類型小鼠發展成為孤獨癥的始動因素。低劑量LPS注射sAPP-α轉基因小鼠、嚴格對照小鼠，對小鼠體內相關指標，尤其是大腦內病理改變進行比較、分析。研究結果表明，代表著有可能發展成為小兒孤獨癥的sAPP-α轉基因小鼠，即使在低劑量LPS注射后，也出現了嚴重的神經系統損害，推測這種神經系統的損害是促發孤獨癥發病的因素之一。

1 材料與方法

1.1動物和試劑 以C57BL/6為背景的轉基因小鼠sAPPα-Tg小鼠由本實驗室從國外引進，于我院基礎研究所動物房養殖，所有的動物實驗均按照我院動物使用方法和規則進行。出生后3周小鼠被選擇作為實驗對象，該時期小鼠神經系統已經發育完全。小鼠注射使用的LPS購買自Sigma公司，PBS重懸粉劑LPS，并調節到所需要的濃度，即用即配。50 μg LPS注射后，每天稱重小鼠直至20天。

1.2動物實驗樣品的準備 50 μg LPS注射小鼠后于不同時間點收獲，封閉容器內乙醚對小鼠進行麻醉后，心臟取血進行外周血細胞計數檢測，分離血漿，-80°C儲存備用。20 ml預冷PBS灌注心臟后，分離小鼠大腦，右側大腦半球迅速于干冰中凍存保留，用于勻漿并提取上清，進行炎癥因子檢測;左側大腦半球分離放置于4%的福爾馬林中過夜，后放置于梯度蔗糖液中脫水，蔗糖濃度依次為10%、20%、30%，且分別保存于4°C過夜。-20°C冰凍切片機將樣品切成25 μm或者40 μm附著于載玻片上的切片，一部分切片以懸浮形式保存于含有100 mmol/L疊氮化鈉的PBS 24孔板中，4°C保存。

1.3組織化學 大腦切片于1%Thioflavin S(ThioS，Sigma)在含有70%的乙醇溶液中孵育5分鐘，蒸餾水漂洗大腦切片2次，使用含有4＇，6＇-diamidino-2-phenylindole(DAPI，Vector Laboratories) 的熒光固定培養基進行固定。Nissl染色用于檢測神經細胞的外形結構，主要檢測神經細胞發育畸形。簡單來說，漂浮大腦切片被固定在載玻片上，空氣中干燥后于1∶1酒精與氯仿中過夜孵育。然后，大腦切片使用梯度酒精溶液進行脫水，0.1% 甲酚紫溶液染色5～10分鐘。蒸餾水漂洗后于95%酒精中干燥脫水，固定培養基進行固定，按照文獻［3］方法進行Cogo紅染色。

1.4免疫組織化學 大腦切片使用各種標記神經細胞的抗體進行標記，包括大鼠抗小鼠 CD11b(1∶1 000;Serotec)、FITC標記的豚鼠抗倉鼠CD40(1∶100;BD Biosciences Pharmingen)、兔抗小鼠鈣離子結合適配器分子1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1)(Iba1)(1∶1 000;Wako Pure Chemicals)、倉鼠抗小鼠 CD11c(1∶50;Pierce)、大鼠抗小鼠趨化因子受體(Chemokine receptor)Ccr2(1∶100;Novus Biologicals)、小鼠抗人 Aβ(clones 4G8 or 6E10;1∶500;Covance)、小鼠 anti-NeuN(1∶3 000;Millipore);然后將已經經過一抗染色的大腦切片使用相應的Alexa Fluor 488和594結合的二抗室溫染色1小時，然后進行 VECTASTAIN Elite ABC kit(Vector Laboratories)結合3，3＇-二二氨基聯苯胺染色顯色，顯微鏡下觀察。

1.5外周血細胞計數(Coulter counter) 50 μg LPS腹腔注射sAPPα-Tg小鼠和嚴格對照小鼠，分別于注射后12、24、48、72、96、120 小時收獲小鼠，心臟采血前首先對小鼠靜脈注射500 U肝素。心臟采集的血液使用20倍5 mm EDTA進行稀釋，-4°C放置1小時后Coulter Counter(Beckman)進行細胞計數和各種血液指標的分析。

1.6ELISA 分離小鼠大腦組織，其中一半置于500 μl 含有 50 mmol/L Tris-HCl、pH7.6、0.01%NP-40、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、0.1%SDS、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和蛋白抑制混合液(Sigma)進行勻漿。3 000 r/min離心5分鐘后收集上清。TNF-α (R＆D Systems) 和 IL-1β (eBioscience)ELISA操作，按照產品說明書進行。

1.7統計學分析 SA(Stereological analysis)按照文獻［4］提供方法進行，簡單來說，漂浮的大腦切片在進行免疫組織化學染色后，每組隨意選擇其中的6片進行計數，NeuN陽性細胞使用Nikon Eclipse 600進行計數。小鼠體重變化曲線和大腦內炎癥因子數據分析，使用prism4.0統計軟件中Nonlinear regression和t-test的方法統計。

2 結果

2.1LPS導致sAPPα-Tg小鼠體重明顯降低 為了觀察LPS注射對sAPPα過表達小鼠影響，我們采用最簡單的體重觀察法。對sAPPα-Tg小鼠和相應對照小鼠進行LPS注射，注射后每天稱重、記錄，直至20天。如圖1所示，sAPPα-Tg小鼠體重明顯降低，與正常小鼠有著顯著性差異。sAPPα-Tg小鼠從出生到3周神經發育完全時，并無任何行為學改變或者病理學改變提示這種小鼠患孤獨癥，因此，sAPPα過表達的小鼠實際上代表了一種潛在的孤獨癥發病者，LPS的注射模擬在小兒發育過程中一種感染因素、一種誘因。圖中轉基因小鼠體重的改變，提示細菌感染，或者是天然免疫系統反應或許是一種誘發具有孤獨癥發病潛質的兒童發病的始動因素。

圖1 LPS注射顯著降低sAPPα轉基因小鼠體重Fig．1 sAPPα over-expression decrease body weight after LPS injection

2.2LPS導致sAPPα-Tg小鼠大腦廣泛損傷 LPS注射小鼠早期體重的改變，提示天然免疫對sAPPα過表達小鼠有著很明顯的影響。因為孤獨癥的早期癥狀學診斷在實驗小鼠模型上非常難于實施，因此我們在注射LPS 14周后收集大腦樣本，進行免疫學組織化學染色。圖2結果表明，sAPPα-Tg小鼠大腦海馬區內有很多無染色區，SA(Stereological analysis)表明sAPPα-Tg小鼠大腦缺損區神經細胞計數與正常小鼠比較有統計學意義(P＜0.05)。初期判斷為其他類型神經細胞的置換，考慮正是這種神經細胞的置換，將可能導致小鼠行為學的改變。為了鑒別該缺損區細胞的類型，我們使用了各種神經細胞的抗體進行染色，但結果顯示并不符合任何一種神經細胞的表型(數據未示)。根據缺損區的特點，以及周圍的血管分布，我們猜測這種無染色的缺損區有可能是一種出血、組織壞死后的纖維增生。

2.3LPS注射引起sAPPα-Tg小鼠大腦內出血的間接證據——血液學指標的改變 我們推測轉基因小鼠大腦內的缺損區，是因為組織出血造成的，是因為sAPPα除表達于大腦組織外，還高表達于血小板上［5］。sAPPα在血小板上的表達，可以妨礙血小板的聚集形成止血栓。為了驗證我們的推斷，采集LPS注射后不同時間點血液，對外周血的細胞計數和各項指標進行檢測、分析。檢測結果如圖3所示，sAPPα-Tg小鼠在LPS注射后早期，HCT和紅細胞減少較明顯，而對照組中則無明顯變化，HCT和紅細胞計數表明LPS可導致早期失血狀態。與普通失血狀態有差異的是，sAPPα-Tg小鼠的血小板改變不明顯，與對照組比較，并無統計學意義。也就是說，sAPPα在血小板上的過表達，促使血小板不能很好聚集形成止血栓，因為血小板在出血狀態的損失主要是形成止血栓，因此短期內血液中含量改變不大。因為注射的LPS劑量較低，所造成的出血可以很快止住，所以表現為血細胞計數、HCT很快恢復，而血小板含量變化不大。

圖2 sAPPα轉基因小鼠神經細胞的損傷和丟失Fig．2 sAPPα-Tg mice have neuronal injury and loss

2.4LPS導致sAPPα-Tg小鼠大腦海馬區廣泛損傷后組織增生 為了鑒別缺損區是否為組織出血后的增生，我們使用了Nissl染色的方法 ，對缺損區和正常區域的細胞進行了比較。結果顯示，不管是正常區域，還是缺損區域都是活細胞，但細胞形態差異很大。Nissl染色似乎建議該區域神經細胞的發育畸形，但免疫神經細胞化學結果(圖2)，又排除了該區域為神經細胞的可能，因細胞形態細長，推測可能為纖維細胞增生修復。

2.5腦內sAPPα過表達對LPS激發大腦內炎癥因子釋放無影響 sAPPα-Tg小鼠大腦內的出血可能與過激的天然免疫有關，為了證明小鼠大腦內sAPPα過表達是否改變大腦內的炎癥反應，我們進行了以下實驗：小劑量LPS注射sAPPα-Tg小鼠和對照組后3天，分離小鼠大腦組織，勻漿并提取上清用于TNF-α、IL-1β、IL-6等前炎因子的ELISA檢測，檢測結果表明，轉基因小鼠和對照組在前炎因子的釋放上無明顯差異(數據未示)，排除腦內過表達sAPPα可引起炎性反應的改變這一推測。

圖3 sAPPα過表達顯著降低外周血HCT值和紅細胞計數Fig．3 sAPPα over-expression decrease HCT and RBC

圖4 Neuronal dysmorphology was revealed by Nissl stainingFig．4 Nissl染色揭示神經細胞形態改變

3 討論

小兒孤獨癥(Autism)是一種近年來發病呈上升趨勢的疾病，其發病對家庭是一種災難，因為無特異有效的治療方法，以及現有方法治療結果的不確定性，使得該病越來越得到家長和社會的關注。對小兒孤獨癥發病機制的深入研究，將為該病治療提供理論基礎。

小兒孤獨癥的發病機制非常復雜：一、大量資料提示本病與遺傳有關：某些遺傳疾病，如苯丙酮尿癥脆性X染色體綜合征均常伴有孤獨癥癥狀;有些報告指出本癥患兒的同胞中有2% ～6%患本癥，較一般人口高50倍［6］;還有研究表明小兒孤獨癥患者體內sAPP-α過表達，與調控該多肽表達基因變異有關;二、有些研究發現孤獨癥與腦器質性損害有關：如果這些損害發生于產前或圍生期，則本癥癥狀出生后即出現;更有研究者認為疫苗免疫所引發的免疫損傷是造小兒孤獨癥的元兇，此觀點曾一度使兒童父母拒絕使用疫苗免疫［7］。但面對著眾多嚴重的感染性疾病，不注射疫苗并非明智之舉。那么，疫苗免疫反應、或者兒童時期的感染是導致孤獨癥發病的元兇，還是對小兒孤獨癥發生、發展起促進作用，還是根本與本病發展不相關，這些問題需要研究者做更深入研究。

sAPP-α轉基因小鼠體內過表達 sAPP-α，模擬一種基因突變可能導致的小兒孤獨癥。對該小鼠的行為學、癥狀學分析表明，該小鼠模型在正常狀態下并不會自動發展為孤獨癥小鼠。sAPPα除了表達于大腦組織內，還表達于血小板上，過表達sAPPα的血小板不易聚集成凝血栓［5］。本實驗使用這種過表達sAPPα的小鼠作為一種潛在的孤獨癥小鼠模型，使用低劑量的LPS注射，觀察小鼠的體重改變，以及大腦內的病理改變。

sAPPα-Tg小鼠體重在LPS注射初期體重明顯降低，說明過表達sAPPα對小鼠的生存狀態有影響，那么這種生存狀態的改變是否與孤獨癥的發生有關?分離感染LPS小鼠大腦組織，切片進行免疫組織化學染色，結果如圖2所示，過表達sAPPα的小鼠出現了大腦海馬區組織病變，病變區各種檢測以及外周血各項指標提示為血管出血后的組織修復。sAPPα過表達于血小板上，LPS通過TLR4激發的天然免疫可以造成組織損傷，研究也發現TLR4對大腦出血影響很大［8，9］。在本研究中，正常小鼠內所激發的天然免疫對小鼠沒有影響，但在sAPPα-Tg小鼠體內，sAPPα的過表達使得血小板很難形成凝血栓，從而導致大腦組織的出血區域。這種在大腦組織內出血損傷是否是導致孤獨癥發病的始動因素，還需要進一步實驗來驗證。那么大腦內過表達的sAPPα在LPS所激發的天然免疫反應似乎影響不大，各種炎性分子釋放量并無明顯改變。

由感染所引起的機體天然免疫反應，在一定程度上對機體發揮著保護作用，是清除微生物感染的第一道防線，但是對于具有孤獨癥發病機制的小鼠，感染或者疫苗所激發的機體天然免疫反應，卻似乎扮演著雙刃劍的角色，在發揮對機體保護作用的前提下，對大腦組織的損害也是顯而易見的。對新生兒體檢過程中，凡是過表達sAPPα的兒童，應該進行有效的預防感染的措施，必要時進行一些免疫抑制的治療，或許能減少感染對大腦組織所造成的損傷，對預防該類兒童發展成為孤獨癥也許是一種有效措施。

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8 Smithason S，Moore S K，Provencio J J.Systemic administration of LPS worsens delayed deterioration associated with vasospasm after subarachnoid hemorrhage through a Myeloid cell-dependent mechanism ［J］.Neurocrit Care，2012;16(2)：327-334.

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