阪崎腸桿菌單克隆抗體的制備與特性鑒定①

周鶴峰 邵 敏 于立強 葛正龍 (遵義醫學院珠海校區生物工程系，珠海519041)

阪崎腸桿菌(Enterobacter Sakazakii，ES)是一種周生鞭毛、革蘭氏陰性無芽胞桿菌，為腸道正常菌群中的一種，屬條件致病菌，新生兒特別是早產兒和免疫力低下的人容易導致腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎，幸存者也容易導致神經系統后遺癥，死亡率高達20% ～50%［1］。近年來，阪崎腸桿菌感染事件國內外相繼報道，已引起世界各國重視，其中較多的是嬰兒配方奶粉污染［2，3］。目前，ES檢測主要依賴傳統細菌學分離培養方法、分子生物學等檢測手段［4］，我國于2005年頒布了ES分離與計數檢驗的行業標準，但上述方法都存在檢測周期長、操作繁瑣等缺點，因此需要建立簡便快速、特異性強、靈敏度高的檢測手段。

國內外尚未有關于制備阪崎腸桿菌單克隆抗體并應用ELISA快速檢測試劑盒對ES進行檢測的報道。本研究利用雜交瘤技術制備出能穩定分泌抗ES的單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的細胞株，為今后阪崎腸桿菌快速檢測試劑盒的研制奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1材料 6周齡雌性BALB/c小鼠，體重18～20克，廣東省醫學實驗動物中心;小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)，中國武漢典型培養物保藏中心;阪崎腸桿菌，廣東環凱微生物科技有限公司;PEG1000、HAT、HT、TMB為 Sigma公司產品;DMEM、胎牛血清為Gibco公司產品;mAb亞類檢測試劑盒、羊抗小鼠IgG-HRP為武漢博士德公司產品;細胞培養板、96孔酶標板Corning公司產品;其它試劑均為進口或國產分析純。

1.2動物免疫 阪崎腸桿菌離心后菌體加1%的甲醛滅活過夜，生理鹽水洗滌，用PBS稀釋至2×108CFU/ml作為免疫原。將菌體與弗氏完全佐劑等體積乳化混勻，按0.5 ml/只菌液量(1×108CFU/ml)腹腔免疫BALB/c小鼠，首次免疫后，于第14、28、42天分別加強免疫三次，間接ELISA法檢測血清效價，以未免疫小鼠血清作為陰性對照，以P/N≥2.1判定為陽性，且最大抗血清稀釋倍數為該血清的效價，超過1∶10 000效價的BALB/c小鼠用于融合。融合前3天，取0.1 ml菌液尾靜脈注射加強免疫。

1.3細胞融合 取免疫小鼠脾細胞和SP2/0，融合劑為PEG1000，按常規操作方法進行。用未免疫小鼠的腹腔巨噬細胞作為飼養細胞，融合后的細胞在含HAT培養基、5%CO2培養箱中37℃選擇培養。

1.4陽性雜交瘤細胞株的篩選及克隆［5］以滅活的菌體作為包被抗原，對細胞上清采用間接ELISA進行檢測，篩選分泌陽性抗體的雜交瘤細胞，以細胞融合的免疫小鼠血清作陽性對照，以SP2/0的培養上清與正常BALB/c小鼠血清作為陰性對照。對陽性細胞株中OD450值高且細胞生長狀態好的采用有限稀釋法進行亞克隆，亞克隆2～3次后對所有孔均為陽性且能穩定分泌抗體的細胞株進行擴大培養，液氮凍存。

1.5mAb腹水的制備 將8周齡BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5 ml液體石蠟，7天后以1×106個/0.5 ml雜交瘤細胞注射BALB/c小鼠，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，3 000 r/min離心5分鐘取上清，分裝，保存備用。

1.6單克隆抗體特異性測定 用滅活的菌體作為抗原包被96孔酶標板，封閉后，采用間接ELISA法，設置空白、陽性對照，mAb分別和13種不同菌株進行交叉反應試驗，交叉反應越少，表明特異性越強。

1.7細胞培養上清液和腹水效價測定 采用間接ELISA方法，以SP2/0的培養上清為陰性對照，測定培養上清和腹水的抗體效價。

1.8單克隆抗體亞類鑒定 按照mAb亞類檢測試劑盒說明書進行操作。

1.9親和力的測定 以不同稀釋度的菌體抗原包被96孔板，間接ELISA法檢測相應的OD值，以不同濃度mAb對數值為橫坐標，以其相應的OD值為縱坐標，繪制出測定曲線，以各曲線上部趨于平坦段的OD值為100%，查出其OD值為50%時的mAb濃度，根據公式計算每株mAb的親和力常數［6］。

1.10染色體分析 采用秋水仙素阻抑法對雜交瘤細胞的染色體進行分析。將篩選得到的雜交瘤細胞擴大培養，用秋水仙素處理，制備有絲分裂中期細胞，操作步驟按說明書進行，Giemsa染色后觀察，每個細胞株觀察100個完整的中期核細胞，計數雜交瘤細胞的染色體數目。

1.11Western blot鑒定 按常規操作方法，將腹水使用飽和硫酸銨粗提蛋白，并適當濃縮。菌體蛋白經SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜上，以純化的mAb為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，進行免疫印跡分析。

2 結果

圖1 雜交瘤細胞株Fig．1 Hybridoma cell lines

2.1雜交瘤細胞株的篩選和亞克隆 雜交瘤細胞株建立過程中共進行2次融合，融合率在90%以上。細胞融合7～10天后，雜交瘤細胞克隆生長至肉眼可見時，采用間接ELISA對其進行檢測，篩選出效價高，細胞團相對較少的細胞孔進行三次以上亞克隆。細胞融合和亞克隆如圖1，細胞融合時，在HAT選擇培養下，一些未融合或自身融合的細胞死亡，背景雜亂，經亞克隆培養后，可見背景相對清晰，單個克隆生長。經篩選和檢測獲得5株能穩定分泌mAb的雜交瘤細胞株，分別命名為：1H7、2H9、2B12、4H4、5A5。

表1 單克隆抗體交叉反應結果Tab．1 Cross reactivity result of mAb

表2 雜交瘤細胞株培養上清和腹水抗體效價Tab．2 Antibody titer in supernatant and ascites

2.2單克隆抗體特異性鑒定 選擇阪崎腸桿菌同屬的陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌以及常見的食源性致病菌等共13種菌進行交叉反應試驗，見表1，2H9能與陰溝腸桿菌出現陽性反應，而與阪崎腸桿菌反應陰性。4H4、5A5也分別與其他幾種菌體發生交叉反應。結果表明，1H7、2B12具有良好的特異性。

2.3細胞培養上清液和腹水效價測定 分別收集陽性雜交瘤細胞培養上清和腹水，按10倍梯度稀釋，間接ELISA方法檢測效價，以P/N值≥2.1時的最高稀釋倍數為此單抗的效價，結果如表2。

2.4單克隆抗體亞類鑒定及親和力的測定 采用抗體亞類試劑盒測定，1H7和2B12產生的單抗的抗體Ig亞類分別為IgG1和IgG2a。間接ELISA法測定mAb的相對親和常數分別為1.23×109L/mol和2.68×109L/mol，顯示制備的單抗與阪崎腸桿菌的親和力高。

2.5染色體分析 正常小鼠脾細胞染色體數目為40條，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為62～68條，兩株雜交瘤細胞株染色體數目分別為104和106條，如圖2所示，表明雜交瘤細胞確為兩個親本細胞融合后產生。

圖2 雜交瘤細胞的染色體分析(Giemsa，×1 000)Fig．2 Chromosome number of hybridoma cells(Giemsa，×1 000)

圖3 單抗的Western blot分析Fig．3 Western blot analysis of mAb

2.6單克隆抗體的特異性檢測 Western blot分析結果表明，兩株mAb能與阪崎腸桿菌的菌體總蛋白發生特異性結合，說明其具有良好的特異性。

3 討論

阪崎腸桿菌是近幾年在乳制品中新發現的一種致病菌，已引起世界各國重視，但由于對其致病機理、免疫反應、基因結構等方面研究尚不清楚，因此，阪崎腸桿菌檢測方法僅為傳統的細菌分離培養方法、分子生物學等手段［7-9］，用膠體金檢測技術和酶聯免疫吸附法等免疫學檢測手段國內外尚未見報道。我國于2005年在《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》GB 4789.40-2010中規定了阪崎腸桿菌改進的傳統檢測方法、普通PCR方法和熒光PCR方法，近年一些研究學者相繼研究了 LAMP法［10］、TaqMan PCR［11］檢測法等改進方法，但在單克隆抗體技術基礎上建立ELISA和膠體金檢測法目前尚未見報道。

本試驗以1%的甲醛滅活的阪崎腸桿菌為免疫原對小鼠進行免疫注射，其中滅活時間要大于16小時，低于16小時菌體尚未完全滅活，腹腔注射后對小鼠產生毒性，造成小鼠大量死亡，培養可見細菌增長。經過多次摸索細胞融合過程中免疫脾細胞和骨髓瘤細胞數目比、融合時間、操作手法等，使融合率提高至90%以上，孫慧慧等［12］曾報道使用PEG1000能實現較高融合率，本實驗使用融合劑為PEG1000也驗證這點，試驗中也曾使用PEG4000，但融合率低于50%，由于PEG的相對分子質量越大、體積分數越高、作用時間越長、對細胞毒性越大［13］。

實驗經三次以上亞克隆，獲得5株陽性雜交瘤細胞株。阪崎腸桿菌為腸桿菌科腸桿菌屬的一種，其產生的抗體特異性決定單抗的應用價值，因此，在對5株陽性雜交瘤細胞株進行交叉反應實驗過程中，選擇同屬的陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌進行檢測，結果表明，2H9、4H4能與陰溝腸桿菌發生陽性反應，另選擇與阪崎腸桿菌同為常見的食源性致病菌進行檢測，5A5與大腸桿菌O157：H7產生交叉反應;同時，抗體的穩定性也是抗體分泌能力的關鍵因素，mAb2H9經多次傳代進行交叉反應時與阪崎腸桿菌產生陰性反應，證明其不能穩定分泌抗體。最后，經特異性篩選得到能穩定分泌抗體的兩株陽性雜交瘤細胞株。

本實驗所獲得的兩株陽性雜交瘤細胞株產生的單抗分別為IgG1和IgG2a亞類且效價相對較高，經Western blot鑒定，能與阪崎腸桿菌菌體蛋白特異性結合。該單克隆抗體的成功制備，為阪崎腸桿菌膠體金檢測試劑盒和ELISA快速檢測試劑盒的制備奠定了基礎。

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