TBX2在甲狀腺癌組織中的表達及其臨床意義①

宋曉環 王曉林 孫冬梅 王忠超 高 航 (長春醫學高等專科學校，長春130021)

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤，居內分泌系統及頭頸部惡性腫瘤的第一位，也是近年來發病率增長最快的惡性腫瘤之一。甲狀腺癌的發生機制目前還不清楚，但與其它腫瘤一樣，甲狀腺癌的發生與基因突變密切相關，控制細胞分化的基因異常表達或停止表達則會導致惡性腫瘤的發生。TBX2是T-BOX基因家族成員之一，屬于發育調控相關轉錄因子基因。有研究發現TBX2在多種腫瘤組織中表達上調，可視為新的腫瘤標志物。但TBX2在甲狀腺癌組織中的表達情況，目前國內外尚未見相關研究報道。本研究采用RT-PCR方法檢測了TBX2mRNA在甲狀腺癌組織中的表達，并探討其臨床意義，以期為甲狀腺癌的臨床診斷及治療提供指導與靶點。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取吉林大學白求恩醫學院病理學系及吉林大學第一臨床醫院2007～2009年甲狀腺腫瘤手術切除標本80例，另選正常甲狀腺組織標本9例。所有標本整理標記好后均進行中性福爾馬林固定，保存于-80℃冰箱中，用于組織勻漿后提取組織總RNA進行RT-PCR檢測目的基因mRNA的表達水平。甲狀腺腫瘤石蠟包埋組織切片經HE染色后，由病理學系兩位臨床經驗豐富的病理醫生雙盲閱片區分組織類型，結果為甲狀腺腺瘤13例，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)28例，甲狀腺濾泡癌(FTC)23例，甲狀腺髓樣癌(MTC)14例，甲狀腺未分化癌(UTC)2例。

1.2RT-PCR 取實驗用正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織，Trizol法提取組織總 RNA作為模板。應用Primer Premier5引物設計軟件設計特異性引物：TBX2 引物：上游引物：5＇-CAC TCG CTT GAC CGA ACC C-3＇，下游引物：5＇-CGC ACT GTC TGT CTG CAC CA-3＇，特異性擴增片段長度為211 bp;GAPDH(內參照)引物：上游引物：5＇-GGG TGA TGC TGG TGC TGA GTA TGT-3＇，下游引物：5＇-AAG AAT GGG AGT TGC TGT TGA AGT C-3＇，特異性擴增片段長度為616 bp。按照北京天根生物技術有限公司產品2×Taq PCR MasterMix使用說明配制反應體系。反應條件：TBX2：94℃ 3分鐘，94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃ 1分鐘，30個循環;72℃ 10分鐘;GAPDH：94℃ 3分鐘，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘，25個循環;72℃ 5分鐘。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后紫外光下拍照。應用天能凝膠圖像分析系統對電泳圖進行表達強度的半定量分析。實驗用引物、DNA Marker(DL-2000)均購自大連寶生物公司。

1.3結果判定 用內參照(GAPDH)光密度值標化TBX2mRNA的光密度值進行半定量分析，得到TBX2mRNA表達的相對含量。具體計算公式如下：TBX2mRNA相對含量=(TBX2光密度值/GAPDH光密度值)×100%。

1.4統計學處理 所有實驗數據用SPSS11.5統計軟件進行處理，各組間數據比較采用t檢驗和χ2檢驗，計量數據以±s表示，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達情況見表1。

2.2TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌及甲狀腺髓樣癌(甲狀腺未分化癌例數太少，無統計學意義)組織中的陽性表達強度(相對系數)分別為0.932±0.256、1.283 ±0.354、1.776 ±0.382、2.627 ±0.532、2.937 ±0.481(見圖 1、2)。

圖1 TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達Fig．1 The expression of TBX2mRNA in normal thyroid，thyroid adenoma and thyroid carcinoma

表1 TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達Tab．1 The expression of TBX2mRNA in normal thyroid gland，thyroid adenoma and thyroid carcinoma

圖2 TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達Fig．2 The expression of TBX2 in normal thyroid ，thyroid adenoma and thyroid carcinoma

3 討論

TBX2基因是T-BOX基因家族成員之一，屬發育調控相關轉錄因子基因，人TBX2基因位于17號染色體長臂2區3帶(17q23)，該基因的同源基因位于鼠的11號染色體上。其編碼蛋白主要通過其C末端的轉錄抑制結構域發揮轉錄抑制作用［1］。TBX2在胚胎發育的各種組織和器官中廣泛表達，對胚胎的形成和組織器官的發育成熟起非常重要的作用。近幾年研究發現，TBX2在多種腫瘤中高表達，如乳腺癌、胰腺癌等。TBX2可從多方面促進腫瘤的發生發展：可以通過抑制p14ARF-Mdm2-p53通路的關鍵蛋白p14ARF的活性而使細胞周期停止在G1/S 和 (或)G2/M 期［2］;或是協同 Myc、Ras等基因作用使細胞向惡性轉化等［3］;TBX2還可能參與了腫瘤化療藥物耐藥性的產生［4-6］;并有可能成為腫瘤治療的有效靶點［7，8］。

本研究發現，TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中表達的陽性率分別為33.3%、46.2%和83.6%。經比較，TBX2mRNA在甲狀腺癌組織中的陽性表達高于其在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤組織中的陽性表達，P＜0.05，差異有顯著性。TBX2 mRNA在不同分化程度的甲狀腺癌組織中與在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤組織中的陽性表達強度相比較，P＜0.01，差異有顯著性。提示TBX2 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達有一定的特異性。TBX2mRNA在甲狀腺癌組織中的陽性表達強度與甲狀腺癌組織的分化程度及組織學分型有關：TBX2mRNA陽性表達強度越強，甲狀腺癌組織分化程度越低、惡性程度越高。

本實驗研究結果與宋曉環等［9］應用免疫組織化學方法檢測TBX2在甲狀腺癌組織中的表達，陳平等［10］檢測TBX2在正常胰腺組織及胰腺癌組織中的表達，徐傲等［11］檢測TBX2在子宮內膜樣腺癌中的表達結果性質一致;提示TBX2同樣也參與了甲狀腺癌的發生發展過程，具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究認為，TBX2參與了甲狀腺癌的發生發展過程并起一定的促進作用，TBX2在甲狀腺癌組織中陽性表達增強可能是甲狀腺癌惡性程度高，增殖迅速的原因之一。檢測其在甲狀腺癌組織中的表達可為甲狀腺癌的臨床診斷、惡性程度的判定及預測預后提供重要的參考指標。TBX2有可能成為臨床診斷、治療甲狀腺癌的一個新靶點，具有重要的臨床意義。

1 Minguillon C，Logan M.The comparative genomics of T-box genes［J］.Brief Funct Genomic Proteomic，2003;2(3)：224-233.

2 Chaubert P，Burri N，Cousin P et al．A novel highly informative polyA microsatellite on the telomeric side of the INK4a/ARF locus［J］.Mol Cell Probes，2001;15(3)：183-185.

3 鄭文婕，童坦君，張宗玉.細胞衰老的重要通路：p16INK4a/Rb和p19ARF/p53/p21Cip1信號途徑［J］.生命的化學，2002;22(4)：314-316.

4 Bilican B，Goding C R.Cell cycle regulation of the T-box transcription factor tbx2 ［J］.Exp Cell Res，2006;312(12)：2358-2366.

5 Guo C F，Zu Z W.Transfer of p14ARF gene in drug-resistant human breast cancer MCF-7/Adr cells inhibits proliferation and reduces doxorubicin resistance ［J］.Chin Cancer Res，2000;158(2)：203-210.

6 Deng X Y，Kim M，Vandier D et al．Recombinant adenovirus-mediated p14(ARF)overexpression sensitizes human breast cancer cells to cisplatin［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002;296(4)：792-798.

7 Vance K W，Carreira S，Brosch G et al．Tbx2 is overexpressed and plays an important role in maintaining proliferation and suppression of senescence in melanomas［J］. CancerRes，2005;65(6)：2260-2268.

8 Butz N V，Campbell C E，Gronostajski R M.Differential target gene activation by TBX2 and TBX2VP16：evidence for activation domaindependent modulation of gene target specificity［J］.Gene，2004;342(1)：67-76.

9 宋曉環，李 偉，孫冬梅et al．轉錄抑制基因TBX2在甲狀腺癌中的表達及其臨床病理意義［J］.中國老年學雜志，2011;19(31)：3696-3697.

10 陳 平，田德安，劉 梅et al.Tbx2蛋白在胰腺癌組織和細胞中的表達及其意義［J］.臨床內科雜志，2007;24(5)：341-343.

11 徐 傲，陳 柯，郭真理 et al．子宮內膜樣腺癌中TXB2、PAX9的表達及其相關性［J］.臨床與實驗病理學雜志，2012;28(2);158-161.