1例Wiskott-Aldrich綜合征臨床特征和致病基因突變分析①

劉維亮 李 芳 何志旭 蔣紅雨 艾 戎 (貴陽醫學院附屬醫院兒科，貴陽550004)

Wiskott-Aldrich綜合征(Wiskott-Aldrich syndrome，WAS)是一種罕見的X連鎖隱性遺傳的原發性免疫缺陷病，又稱濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征，臨床特征為血小板減少伴小血小板、濕疹、反復感染、易患淋巴系統惡性腫瘤和自身免疫性疾病。1994年通過定位克隆技術分離出致病基因WAS蛋白(Wiskott-Aldrich protein，WASP)基因。WASP基因位于X染色體短臂Xp11.22-11.23，約長9 kb，含12個外顯子，編碼502個氨基酸［1］。WASP基因突變可影響WASP表達，導致造血細胞對外界刺激反應時的信號傳導和細胞骨架組合障礙，影響血小板數量、大小及聚集，造成淋巴細胞遷移，信號傳導及免疫突觸形成異常等［2］。WASP基因突變可產生多種臨床表型。WASP基因突變、WASP表達與臨床表型密切相關，國內對該病研究相對較少，我們通過對一Wiskott-Aldrich綜合征家系進行臨床及WASP基因遺傳學研究，初步探討該病的臨床特征及致病基因突變特點。

1 材料與方法

1.1對象 患兒，男，1歲5月，因“反復感染，血小板減少，皮疹11月”入院，考慮濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征(WAS)，該患兒及其父母為本研究對象。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取 留取患兒外周靜脈血1～3 ml，EDTA 抗凝，酚-氯仿法提取基因組DNA，于-20℃冰箱保存備用。本研究得到了貴陽醫學院附屬醫院倫理委員會的批準，基因分析獲取了患兒家長的知情同意。

1.2.2突變檢測 針對WASP基因所有12個編碼外顯子及外顯子和內含子交界處進行PCR擴增測序。PCR擴增引物設計及條件參照文獻［3］，PCR反應體系為50 μl中進行，含10×PCR緩沖液，0.1 mmol/L dNTPs，20 mmol/L Mg2+和 1.25 U Taq DNA polymerase，10 pmol/μl上下游引物，模板 DNA 200 ng，測序用PCR產物應用雙脫氧末端終止法進行測序(美國ABI公司3730XL測序儀)。測序結果在BioEdit軟件中進行分析，并與GeneBank數據庫中人類基因組序列WASP進行比對分析，以檢測有無序列突變。先取患者做突變分析，若測序證實突變者，在家系內其父母中進行突變分析，以確認患兒該突變是源自遺傳傳遞還是自發突變。

2 結果

2.1臨床表現及實驗室檢查結果 患兒，男，1歲5月，貴州籍，母親為孕2產2，患兒精神運動發育未見特殊。有1姐姐3歲體健。患兒于3月齡時有暗紅色血絲便;6月齡時有頭皮、顏面部濕疹，伴水皰及脫屑;從6月齡起反復發生肺炎，頻率約每月1次，常有腹瀉;患兒濕疹加重與感染明顯相關;且從6月齡起發現血小板反復減少，四肢反復出現針尖至針帽大小出血點，身體多處見瘀斑，患兒1歲時曾有數次少量鼻出血，多次使用甲強龍琥珀酸鈉及靜脈用人免疫球蛋白沖擊治療，血小板波動于5×109～67×109L-1間。查體：T 38.8℃，P 120 次/分，R 32 次/分，BP 88/56 mmHg，Wt 8 kg ，營養中等，精神差，呼吸稍促，貧血及輕度脫水貌，皮膚彈性差，皮膚粘膜、甲床蒼白，雙下肢可見陳舊性瘢痕及針尖大小出血點，不高起皮面，壓之不褪色，淺表淋巴結未捫及腫大，前囟稍隆起，約0.8 cm×0.8 cm，眼窩凹陷，雙瞳孔等大等圓，直徑約2.5 mm，光敏。口周蒼白，咽紅，扁桃體無腫大，頸軟，雙肺呼吸音粗，偶聞及痰鳴音。心率120次/分，律齊，有力，各瓣膜聽診區未聞及雜音，腹平軟，肝肋下1 cm，劍突下1 cm，質軟、無壓痛，脾未捫及腫大，腸鳴音存，移動性濁音(-)。四肢肌力肌張力可，肢端溫暖，生理反射存在，病理反射無特殊。輔查：血常規示：WBC 22.88×109L-1，NEUT#19.35 × 109L-1，L 2.83 × 109L-1，RBC 3.29 ×1012L-1，HGB 63.00 g/L，PLT 60 ×109L-1，MPV 5.5fl，網織紅細胞計數 48.8 ×109L-1，網織紅細胞百分比1.48%。血生化：谷丙轉氨酶19.3 U/L(10～40)，谷草轉氨酶30.64 U/L(10～42)，超敏C反應蛋白90 mg/L(0～8)，CO2結合力22 mmol/L(21 ～31)，K+3.45 mmol/L(3.5 ～5.5)，Na+135.7 mmol/L(135～145)。尿常規陰性，大便常規：稀便，潛血弱陽性。TORCH：巨細胞病毒抗體IgM，IgG陽性。Coomb＇s試驗陽性。胸片示：左上肺感染。骨髓涂片：成熟紅細胞部分中度小細胞輕度低色素，骨髓細胞內外均缺鐵，巨核細胞數目過少。淋巴細胞及亞群：CD3(T)60.2%(64.62% ～77.08%)，CD4(Th)19.0%(32.69% ～44.23%)，CD8(Ts)31.4%(24.81% ～35.99%)，CD4/80.61(1.04～1.72)，CD19(B)14.3%(6.38% ～12.46%)，CD16+56(NK)25.2%(14.47% ～30.27%)，T+B+NK 99.7%(85.47% ～119.81%)。體液免疫(1歲1月)：IgG 11 933 mg/L(3 490～11 390)(5天前曾輸注人免疫球蛋白沖擊治療)，IgA 1 194 mg/L(130～820)，IgM 1 698 mg/L(480～2 290)，抗體測定：類風濕因子測定283 U/ml(0～30)，抗核抗體(ANA)1∶100陽性核均質型++;患兒1歲5月時復查：IgG 21 500 mg/L(4+月前曾輸注人免疫球蛋白沖擊治療)，IgA 1 620 mg/L，IgM 1 340 mg/L，抗體測定：類風濕因子測定480 U/ml，ANA 1∶100陽性核均質型、胞漿顆粒型。診斷：1.Wiskott-Aldrich綜合征;2.膿毒血癥?;3.支氣管肺炎;4.小兒腹瀉伴輕度脫水;5.自身免疫性溶血性貧血(中度);6.抽搐原因：顱內感染?入院后予抗感染，輸注洗滌紅細胞糾正貧血，對癥支持治療等，住院第2天患兒仍持續高熱，并出現反復抽搐及進行性的意識障礙，查頭顱CT無明顯異常。家屬要求自動出院。

圖1 WAS患兒 WASP 基因 c．665C ＞T(p．R211X)突變Fig．1 Mutation analysis of WASP gene by direct sequencing in the patient，c．665C ＞ T(p．R211X)，the mutation is shown by an arrow

2.2WASP基因測序結果 患兒為WASP基因第7外顯子中第665位核苷酸C突變為T(c.665C＞T)，導致211位密碼子發生無義突變，該位置提前出現終止密碼(p.R211X);其母親一條等位基因上也有WASP基因同一位點的相同無義突變，為此突變基因攜帶者;患兒父親基因型正常(圖1～3)。

圖2 患兒母親為c．665C＞T突變基因攜帶者Fig．2 The patient's mother was the carrier of the heterozygosis mutation(c．665C ＞T)

圖3 患兒父親的正常WASP基因序列Fig．3 The patient's father had not the heterozygosis mutation

3 討論

WAS是一種罕見X連鎖隱性遺傳性原發性聯合免疫缺陷病，發病率為1/100萬～1/400萬，多起病于6個月以內的男嬰。現已發現超過300種其WASP致病基因缺陷，包括錯義、無義、插入、缺失和剪接位點突變等。錯義突變為本病最常見的突變類型，其他常見突變類型為剪接位點突變、缺失突變、無義突變。錯義突變主要分部于WASP基因第1、2、3和4外顯子上，而其他突變類型分散分布于該基因，本病已報道的5個基因突變熱點為168C＞T(T45M)，290C ＞N/291G ＞N(R86S/G/C/H/L)，IVS6+5 g ＞a fs stop aa 190/normal，665C ＞ T(R211X)，IVS8+1 g＞ a/c/t，fs stop aa246。前3個突變熱點主要與該病輕型表型X連鎖的血小板減少癥(X-linked thrombocytopenia，XLT)相關聯，XLT為WAS的一種輕型表現型，XLT僅以血小板減少伴小血小板為臨床特征，患兒可能出現輕度濕疹，并可能具有正常的免疫功能。而后2個突變熱點主要與經典的WAS表型相關聯［4］。

通過WAS表型評分標準［5］對本病的臨床型表型進行評分。1分(輕型XLT)：僅有血小板減少、血小板小，無或輕度免疫缺陷;2分(重型XLT)：為輕型XLT伴輕度或暫時濕疹、輕度免疫缺陷，感染不頻繁，無并發癥;3分(輕型WAS)：血小板減少、血小板小、中度濕疹、免疫缺陷和感染;4分(重型WAS)：輕型WAS伴嚴重、難以控制的濕疹和危及生命的感染;5分：XLT或WAS伴自身免疫性疾病和(或)惡性疾病。

總結國外(http：//homepage.mac.com/kohsukeimai/WASP/WASP base.html)及 Jin 等［4］已報道的665C＞T(R211X)突變病例，其中18例WAS表型評分5分有1例(5.6%)，4分有12例，2～3分有5例，國外已報道此突變占所有WASP基因家系突變百分率為4.4%。國內報道的 R211X突變病例［6-10］，其中6例WAS表型評分5分(伴惡性腫瘤)有1例(16.7%)，4分有3例，3分有2例，此突變占所有WASP基因家系突變百分率為10.3%。國內外均報道該位點為突變熱點。

通過臨床特征及WASP基因檢測結果，該患兒明確診斷為Wiskott-Aldrich綜合征。其WAS表型評分5分，患兒 Coomb＇s試驗，自身抗體中 ANA及類風濕因子均陽性，伴有自身免疫性疾病自身免疫性溶血性貧血。該患兒基因型為R211X，此基因型患兒擁有典型的WAS表型且伴有自身免疫性疾病的臨床特征為國內首次報道，豐富了該病突變熱點基因型的臨床特征譜。

該患兒為重型WAS，本研究支持以往的觀察報道，即重型患兒往往在7～12外顯子發生移碼或無義突變［11］。另外，R211X基因型國內外報道臨床型表型差異較大，我們未行WASP表達檢測，推測相同的基因型可能表達有不同的蛋白型，進而影響表型，其中可能有其他修飾基因及環境因素影響WASP基因表達而起作用。

WAS為聯合免疫缺陷病，有不同程度的體液、細胞免疫異常，以T細胞免疫缺陷為主，患者免疫缺陷為漸進性，多數患者血清IgG輕度降低或正常，IgM下降，IgA和IgE升高。T細胞數量減少［9］。我們報道的患兒Th細胞數量減少，B淋巴細胞數量增加，血清IgA水平進行性升高，IgM水平進行性降低，IgG水平進行性升高可能與近期輸注人免疫球蛋白沖擊治療有關。患者免疫水平的變化可能與病情進展有關。因患者的體液、細胞免疫水平變化較大，WAS診斷不應僅基于免疫分析結果。

WAS患兒臨床極易誤診為特發性血小板減少性紫癜(ITP)，因WAS患兒骨髓常規檢查缺乏特征性改變，兩者均有血小板減少。當臨床發現男性患兒持續血小板減少伴小血小板，反復濕疹、感染，免疫缺陷，特別是有小血小板時，應高度考慮WAS，可進一步行WASP基因檢測及應用流式細胞術檢測外周血單個核細胞WASP表達明確。骨髓或臍血干細胞移植可快速重建患兒造血及免疫系統，是目前根治WAS最有效的方法。WAS的基因治療正在基礎及臨床研究中。無條件移植患者，可行脾切除，使患兒血小板數量上升，但無法糾正血小板體積小;及免疫球蛋白替換治療。急性期控制感染、止血、輸血，及對癥支持治療。

我們通過臨床特征及WASP基因檢測，明確診斷1例中國Wiskott-Aldrich綜合征患兒。我們于國內首次報道WASP基因型(p.R211X)患兒擁有典型的WAS表型且伴有自身免疫性疾病。通過臨床特征分析，有利于探討深入的基因研究。其WASP基因突變分析對于該病患兒明確診斷，判斷預后具有重要意義，尤其是對不典型和散發患兒明確診斷、檢測攜帶者及攜帶者胎兒的產前檢查有重要意義，特別是對相同基因型伴有不同的臨床型，通過表達的不同蛋白型可進一步明確影響因素。

致謝:香港大學醫學院兒科系劉宇隆、陳冠榮兩位教授在課題研究中給予的技術指導。

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3 Chan K W，Lee T L，Chung B H et al．Identification of five novel WASP mutations in Chinese families with Wiskott-Aldrich syndrome［J］.Hum Mutat，2002：20：151-152.

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