大腸桿菌檢驗方法的探究與分析

蘇麗晶

(內蒙古呼倫貝爾市海拉爾區人民醫院檢驗科 內蒙古呼倫貝爾 028000)

呋喃唑酮片一般適用于大腸桿菌或痢疾桿菌引發的腸炎和菌痢等疾病的治療,對大腸桿菌具有較強的抑菌和殺菌能力,屬于硝基呋喃類抗菌藥物[1～2]。應用衛生學中常用的處理樣品的檢查方法難以檢出呋喃唑酮片中大腸桿菌,這是檢驗工作中一個長期困難。本研究分別應用一次離心法、離心濾膜法、離心雙重濾膜結合法進行呋喃唑酮片大腸桿菌檢驗,觀察對比大腸桿菌檢出率情況,取得了滿意的檢出效果,現將其具體過程與結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取規格為0.10g/片的呋喃唑酮片(國藥準字H52020295,貴州省科暉制藥廠),大腸桿菌CMCC(B)【44102】、孔徑規格分別為3.0、1.2μm和0.45μm的混合纖維素酯微孔濾膜、伊紅美藍瓊脂、膽鹽乳糖增菌液、大腸桿菌生化反應培養基均為中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 檢測方法

一次離心法:將呋喃唑酮片與大腸桿菌CMCC制成供試液,離心后將上清液取出進行大腸桿菌的檢測。離心濾膜法:先將呋喃唑酮片與大腸桿菌CMCC制成供試液,進行離心,離心后將上清液取出后采用孔徑為0.45μm微孔濾膜進行過濾,過濾后將溶液取出進行大腸桿菌的檢測;離心雙重濾膜法:先將呋喃唑酮片與大腸桿菌CMCC制成供試液,進行離心,離心后將上清液取出后,依次采用孔徑1.2μm的微孔濾膜與孔徑0.45μm的微孔濾膜進行過濾,或者依次采用孔徑3.0μm的微孔濾膜與孔徑0.45μm的微孔濾膜進行過濾,過濾后將溶液取出進行大腸桿菌的檢測。過濾法將0.45μm的濾膜取出,分別將3種方法得到的檢測溶液中加入膽鹽乳糖增菌液中進行增菌操作,時間為48h,渾濁、產氣判定為檢出大腸桿菌。再進行伊紅美藍瓊脂平板分離檢驗,觀察菌落的長出情況。本實驗所用離心機上海安亭離心機TDL-5-A,離心半徑為16cm,轉速為5000轉/min。

1.3 檢出判定

仔細觀察膽鹽乳糖增菌液的情況,如果膽鹽乳糖增菌液渾濁、產氣判定為檢出,如果膽鹽乳糖增菌液無渾濁、未產氣則判定為未檢出;伊紅美藍瓊脂平板經過7～14d的培養后觀察大腸桿菌的菌落生長情況,如果伊紅美藍瓊脂平板分離有典型大腸桿菌菌落長出判定為檢出[3],如果伊紅美藍瓊脂平板分離沒有典型大腸桿菌菌落長出則判定為未檢出。

表1 不同檢驗方法大腸桿菌檢出結果對比

表2 人工污染5d樣品大腸桿菌檢出情況

1.3 統計學分析

全部數據采用SPSS13.0統計學軟件進行處理,組間比較以t和χ2檢驗,P＜0.05為差異有顯著性,具有統計學意義。

2 結果

分別應用一次離心法、離心濾膜法、離線雙重濾膜法進行呋喃唑酮片大腸桿菌的檢驗。其中一次離心法檢驗中,膽鹽乳糖增菌液呈現微渾,伊紅美藍瓊脂平板分離沒有菌落長出,檢查結果為沒有檢出;離心濾膜法檢驗中,膽鹽乳糖增菌液呈現澄清,伊紅美藍瓊脂平板分離沒有菌落長出,檢查結果為沒有檢出;離心雙重濾膜法檢驗中,膽鹽乳糖增菌液呈現渾濁、產氣,伊紅美藍瓊脂平板分離有典型大腸桿菌菌落長出,檢查結果為檢出。應用離心雙重濾膜法檢驗的檢出效果,明顯優于應用一次離心法檢驗、離心濾膜法檢驗的效果,組間差異顯著(P＜0.05),具有統計學意義。3種方法具體檢出情況詳見表1。采用6批加入大腸桿菌藥品樣本進行人工污染5d,應用離心雙重濾膜法進行大腸桿菌檢驗,6批樣品膽鹽乳糖增菌液均呈現渾濁、產氣,伊紅美藍瓊脂平板分離均有典型大腸桿菌菌落長出。樣品大腸桿菌陽性檢出率為100%。具體人物污染樣品大腸桿菌的檢出狀況詳見表2。

3 討論

大腸桿菌的檢驗方法有很多種,其中一次離心和二次離心法最為常。多種藥物在一次離心或者二次離心之后,溶液中的藥物濃度則會降至藥物的最低抑菌濃度之下。而對于采用離心法不能使藥物的濃度降至最低抑菌濃度之下的藥物,可以采用0.45μm孔徑的濾膜進行過濾,多數藥物于過濾之后,溶液中的藥物濃度則會降至藥物的最低抑菌濃度之下。而對于采用0.45μm孔徑的濾膜進行過濾后,藥物的微量殘留所達到的濃度也比藥物的最低抑菌濃度高的藥物,則可以使用離心雙重濾膜法進行過濾。而對于呋喃唑酮而言,雖然呋喃唑酮在水中的溶解度僅為40mg/L,但于膽鹽乳糖增菌液中,呋喃唑酮的最低抑菌濃度為0.01mg/L,經過一次離心,抑菌濃度均無法低于0.01mg/L。在應用離心濾膜法后,因為供試液經0.45μm孔徑的濾膜進行過濾時有一定殘留,也會導致膽鹽乳糖增菌液中呋喃唑酮濃度比最低抑菌濃度0.01mg/L高,進而使大腸桿菌不能繁殖。本研究中應用的離心雙重濾膜法,能夠有效去除溶解于水中的少量呋喃唑酮,同時將離心后上清液中的呋喃唑酮殘留攔截在1.2μm孔徑與3.0μ孔徑的濾膜中,保證0.45μm孔徑的濾膜上呋喃唑酮較少,進而降低膽鹽乳糖增菌液內呋喃唑酮的濃度,提高大腸桿菌的陽性檢出率。人工污染的大腸桿菌樣品在5d后能夠全部檢出,也能夠為離心雙重濾膜法在檢驗過程中對于大腸桿菌在膽鹽乳糖增菌液的繁殖沒有影響提供佐證[4]。

綜上所述,離心雙重濾膜法能夠有效解決呋喃唑酮在膽鹽乳糖增菌液中濃度過高的問題,應用離心雙重濾膜結合法進行呋喃唑酮片大腸桿菌的檢驗,操作簡單,檢出率高,值得臨床上應用推廣。

[1] 崔紅華.大腸桿菌的快速檢驗研究[J].長春中醫藥大學學報,2007,23(3):73.

[2] 巨煜華.泮托拉唑聯合克拉霉素、呋喃唑酮治療幽門螺桿菌陽性消化性潰瘍60例臨床觀察[J].內科,2011,6(5):440～441.

[3] 張海平,楊天鳴,張志海,等.吡哌酸片大腸桿菌檢驗方法的探索[J].衛生職業教育雜志,200,21(6):85.

[4] 趙明蓮.去除呋喃唑酮片抑菌作用的方法探討[J].中國藥事,1998,12(5):288～289.