MRE11基因在食管鱗癌中的表達

劉青松 朱興春 張均 袁國華 羅雄燕 楊明輝 唐中

(1.川北醫學院醫學檢驗系; 2.川北醫學院附屬醫院檢驗科; 3.川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所 四川南充 637000)

食管癌是全世界常見的惡性腫瘤之一。染色體基因不穩定是人類腫瘤發生發展的中心環節,而端粒通過保護染色體的完整性而維持基因組的穩定性。端粒異常可激活毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白(ATM)和共濟失調毛細血管擴張癥Rad3相關蛋白激酶(ATR)依賴的DNA損傷反應途徑導致DNA雙鏈斷裂(DSBs),并促進失去功能的端粒非同源末端融合(NHEJ)[1]。由MRE11、Rad50和Nijmegen斷裂綜合癥蛋白(Nbsl)組成的MRN復合物對DSBs和NHEJ具有保護作用[2]。MRE11具有DNA結合、雙鏈DNA3’-5’外切酶和單鏈DNA結構特異性內切酶活性等功能,這些功能對于DNA末端封閉而防止DNA末端結構融解是必需的。因此研究Mre11對于食管癌的發生機制的深入理解具有重要意義。為此,本文旨在通過實時熒光定量PCR方法檢測Mre11 mRNA在食管癌組織中的表達。

表1 定量PCR的基因引物序列

圖1 MRE11 PCR產物電泳圖

圖2 MRE11 PCR產物溶解曲線圖

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象 收集2009年5月至2010年12月在川北醫學院附屬醫院手術的食管癌中心組織和癌旁組織22例。所有患者均為漢族人,其中男性21例,女性1例,年齡42～74歲,平均年齡62歲。所有病例通過病理組織細胞形態學加以確診。所有標本儲存在用DEPC水處理的EP管中,-80℃低溫保存備用。同時詳細記錄食管癌相關記錄,如性別、年齡、病理分型、臨床分期、腫瘤大小等相關信息。其中臨床分期標準為:T1腫瘤侵犯粘膜或粘膜下層,T2腫瘤侵犯肌層,T3腫瘤侵犯外膜,T4腫瘤侵犯鄰近結構。

1.1.2 器材與試劑 本研究涉及主要器材與試劑包括:Trizol(天根);逆轉錄試劑盒(成都博瑞克);PCR試劑(天根,2×Taq PCR Master Mix);定量PCR試劑(ABGAB); PCR儀(BIO-RAD Mycycler);定量PCR儀(ABI 7900HT);凝膠成像儀(BIO-RAD);紫外分光光度計(島津,UV-2550)。

表2 MRE11基因在食管鱗癌組織中的表達(±s)

表2 MRE11基因在食管鱗癌組織中的表達(±s)

組別 例數 MRE11 t P癌中心組織22 0.14±0.12 2.90 0.006癌旁組織 21 0.29±0.22

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和逆轉錄 (1)總RNA抽提與cDNA鏈合成:剪取約100mg組織放入陶瓷碾缽中,加液氮進行碾磨成粉末,然后加Trizol試劑1mL,繼續碾磨。將碾磨液轉入1.5mL的Ep管,提取總RNA,取2μL總RNA溶于48μL經DEPC處理的水中,用紫外分光光度計測定其A260/A280值,檢測其純度和濃度。按每20μL體積加2μg RNA比例,依照逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。(2)實時定量PCR:MRE11和內參APL13A引物由上海Sangon公司合成,序列見表1。PCR反應體系總體積為20μL,各反應參數如下:2.5 Master mix 9μL;上下游引物(10μmol/L)各0.25μL,cDNA 1μL。反應條件:經50℃ 2min熱啟動和95℃5min變性后,反應體系再經40個循環的95℃ 15sec,60℃ 1min反應,并在此循環過程中收集熒光信號。同時設立無模板對照監控反應進程。在實驗結束后進行溶解曲線分析,以鑒定產物是否單一,確保結果的準確性。(3)統計方法:數據采用SPSS10.0 for windows做Explore正態性分析,MRE11的表達呈正態分布,因此其表達量用(±s)表示,并進行獨立樣本t檢驗,以P<0.05為顯著差異。

2 結果

2.1 MRE11基因PCR產物分析

在進行定量PCR前,我們采用普通逆轉錄PCR對MRE11基因進行了分析,以鑒定MRE11基因引物的是否可擴增出特異性MRE11基因。電泳結果顯示,該引物不僅能得到單一的PCR條帶,而且引物二聚體含量極低(圖1)。說明該引物可用于基于SBRY-Green熒光染料的實時熒光定量PCR分析。

在定量PCR反應結束后,我們立即對產物進行解離曲線分析。發現在MRE11基因PCR產物理論TM值(84℃)出有單一峰值出現(實測值為81.5℃),且在其他溫度下無峰出現(圖2)。說明我們得到的數據為MRE11基因的真實反應,可用于下一步分析。

2.2 MRE11在食管鱗癌組織中的表達

我們檢測了22例食管鱗癌組織及其相應癌旁組織MRE11基因的表達。其中22例癌組織中均得到相應信號,但癌旁組織有1例沒有檢測到熒光信號。因此我們對22例癌組織標本和21例癌旁組織標本MRE11基因的表達進行了分析。與癌旁組織相比,癌組織中的MRE11基因表達顯著降低,具有統計學意義(P=0.006)(表2)。

2.3 MRE11 mRNA表達與食管鱗癌臨床病理關系

為了明確MRE11的表達在食管鱗癌的發生發展中的意義,我們對其表達與食管鱗癌的臨床病理進行了進一步分析。結果發現,MRE11 mRNA的表達與年齡、分化程度、有無淋巴結轉移以及有無吸煙、飲酒史均無關,但與臨床分期和腫瘤生長速度有關。數據顯示,T1和T2期患者的MRE11 mRNA的表達顯著低于T3和T4期患者(P=0.000),腫瘤生長較慢的患者MRE11 mRNA的表達也低于生長較快的患者(P=0.012)。

3 討論

有研究發現,食管鱗癌存在很高的染色體畸變率[3]。染色體畸變引起的染色體基因組不穩定是人類腫瘤發生發展的中心環節,維持適當的端粒是全基因組穩定的關鍵。哺乳動物端粒由TTAGGG重復片段組成,并與端粒保護蛋白復合體(shelterin)結合。端粒的磨損或shelterin脫帽可引起DNA損傷反應和無功能端粒末端融合[4],從而導致基因組DNA的不穩定性。DNA損傷反應是一個包含信號轉導、細胞周期調節和DNA修復的功能網絡。由MRE11組成的MRN復合物是DNA損傷反應的關鍵調節復合物。研究表明,MRN復合物在維持端粒、細胞周期檢查點信號系統、DNA復制和DSBs過程都是必需的[5]。

MRN復合物作為DNA DSBs的感應元件,位于斷裂位點并重征ATM[5]。MRE11是MRN復合物的重要成員之一,具有DNA結合、雙鏈DNA3’-5’外切酶和單鏈DNA結構特異性內切酶活性等功能。Deng[1]等研究表明,MRN復合物是細胞傳感端粒酶異常的物質,MRE11核酸酶的活性可能導致端粒3’端失去融合染色體的能力。當MRN復合物感應有端粒磨損,端粒保護功能喪失時,MRE11核酸酶活性在3’端端粒懸凸消除,從而促進端粒融合,導致染色體基因組不穩定性。此外,MRE11還能保護端粒重復片段。結果表明,MRE11 mRNA在食管鱗癌組織中的表達相比癌旁組織顯著降低。可見,MRE11降低可能是食管鱗癌發生的重要內因。

進一步分析MRE11 mRNA和食管鱗癌臨床病理特征關系時發現,MRE11 mRNA在食管鱗癌組織中的表達與年齡、分化程度、有無淋巴結轉移以及有無吸煙、飲酒史均無關,但與臨床分期和腫瘤生長速度有關。結果表明,在臨床分期較低患者(T1和T2期)MRE11 mRNA的表達顯著低于臨床分期較高(T3和T4期)患者,腫瘤生長較慢的患者MRE11 mRNA的表達也低于生長較快的患者。這可能是因為MRE11表達的降低影響MRN復合物形成,導致細胞周期檢查點信號系統紊亂,從而影響腫瘤細胞的生長速度。總之,我們的實驗結果表明,不管在食管鱗癌的發生,還是在食管鱗癌的生長發展過程,MRE11均具有重要作用。

[1] Deng YB,Guo XL,Ferguson DO,et al.Multiple roles for MRE11 at uncapped telomeres[J].Nature,2009,460(7257):914～918.

[2] Yang YG,Saidi A, Frappart PO,et al. Conditional deletion of Nbs1 in murine cells reveals its role in branching repair pathways of DNA double-strand breaks[J].EMBO J, 2006,25(23):5527～5538.

[3] 康維,姚漢清,房麗麗.食管鱗癌3、8、10、20和Y染色體的非整倍性分析[J].遺傳,2009,31(3):255～260.

[4] Palm W,de Lange T. How shelterin protects mammalian telomeres[J].Annu Rev Genet,2008,42:301～334.

[5] Yoshihiko M, Hiroshi S, and Masaru M.Molecular mechanisms of esophageal squamous cell carcinogenesis: clues to improve treatment outcomes [J].Ann Thorac Cardiovasc Surg,2010,16(6):387～388.