紅色熒光蛋白在釀酒酵母中的表達特性研究

史彥薇，王志芳，王偉，安建梅，孔建強

紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是從珊瑚綱生物中分離出來的一類與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）同源的熒光蛋白，其在紫外光的照射下可發射紅色熒光[1]。自 1999年首次被分離出來至今，紅色熒光蛋白以其激發和發射波長較長、細胞內成像背景低、細胞毒性小而備受關注并廣泛應用。迄今為止，紅色熒光蛋白已經擁有多種突變體[2-10]，與最初的紅色熒光蛋白相比，突變體紅色熒光蛋白在成熟時間、熒光強度、發射波長以及聚集程度方面均有很大改觀，同時更多成熟時間短[2-4]、熒光強度強[5-7]、發射波長更長的單體紅色熒光蛋白[8-10]也得以成功開發應用。不僅如此，紅色熒光蛋白性能的改善還使其更多地被用于分子標簽[11-13]以及蛋白相互作用[14-16]的研究。為了更好地拓寬紅色熒光蛋白的應用領域，本實驗嘗試將紅色熒光蛋白 Dsred 基因導入釀酒酵母菌，實現紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌體內的異源表達；同時為縮短紅色熒光蛋白的成熟時間，對缺水環境中紅色熒光蛋白的表達特性進行了分析，以期為紅色熒光蛋白更好地應用于雙分子熒光互補（bimolecular fluorescent complementary，BiFC）[14-16]等蛋白互作技術研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 大腸桿菌菌株 E.coli TG1 和釀酒酵母菌株 W303-1B（MATa；ade2-1；his3-11,his3-15；leu2-3, leu2-112；ura3-1；trp1-1）均為本實驗室保存；pMD18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司；pYeDP60 釀酒酵母表達載體為法國Werck-Reichhart 教授饋贈。

1.1.2 試劑與儀器 KOD Plus 高保真 DNA 聚合酶購自日本 Toyobo 公司；鮭魚精 DNA 購自日本 Wako 公司；聚乙二醇（PEG4000）購自北京欣經科生物技術有限公司；醋酸鋰和伴刀豆球蛋白購自美國 Sigma 公司；酵母質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；快速連接試劑盒 In-fusionTMAdvantage PCR Cloning Kit/Cloning Enhancer Kit 購自美國 Clontech 公司；蛋白Marker 購自立陶宛 Fermentas 公司；其他試劑均為分析純。

LB 大腸桿菌培養基（含 10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl；固體培養基添加1.5% 瓊脂粉）購自德國 Merck 公司；YPD 酵母培養基（含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 細菌蛋白胨、20 g/L 葡萄糖；固體培養基添加 2% 瓊脂粉）和 YPG 酵母誘導培養基（含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 細菌蛋白胨、20 g/L 半乳糖）購自英國Oxoid 公司；SCD 酵母脅迫培養基（含 7 g/L 無氨基酵母氮源、2 g/L drop-out 混合物、20 g/L 葡萄糖；固體培養基添加 2% 瓊脂粉）、SCG 酵母脅迫誘導培養基（含 7 g/L 無氨基酵母氮源、2 g/L drop-out混合物、20 g/L 半乳糖）和 SC-Ade-Ura 培養基購自北京欣經科生物技術有限公司。

Eclipse 80i 正置熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產品；Spectra Max190 酶標儀為美國 MD 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 Dsred 基因的克隆 采用連續重疊 PCR方法快速克隆 Dsred 基因[17]。根據已經發表的Dsred 基因的序列（GenBank：DQ005468）設計 8對引物（表 1）。在 8 對引物中，除 Fyedp60Red 和Ryedp60Red 之外，每條引物全長均為 59 nt（nucleotide，核苷酸），其中包括14 nt的重疊序列。所有引物均由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

首先，以 Fred1 和 Rred1 互為模板，采用重疊 PCR 方法擴增獲得 Dsred 基因初始序列，PCR擴增反應體系總體積為 50 μl，含 dNTP（2 mmol/L）5 μl、KOD Plus buffer 5 μl、KOD Plus 聚合酶 1 μl、Fred1 和 Rred1 各 1μl、MgSO4（25 mmol/L）2 μl、水 35 μl。然后，以該初始序列為模板，通過連續重疊 PCR 方法合成全長 Dsred 基因，擴增循環參數：98 ℃ 10 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃ 7 min。反應完畢，取 PCR 擴增產物行 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

表 1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

將擴增獲得的全長 Dsred 基因與 pMD-18T載體分別經 BamH I、EcoR I 雙酶切后，以 T4DNA連接酶進行連接，連接產物轉化 E.coli TG1，篩選、挑取陽性克隆培養，進行測序鑒定，序列鑒定正確的重組載體命名為 pMD-Dsred。

1.2.2 重組表達載體的構建 以 Fyedp60Red/Ryedp60Red 為引物（表 1），采用連續重疊 PCR方法擴增得到一條長約為 700 bp 的序列，將該序列通過In-fusion 方式連接到經 BamH I、EcoR I 雙酶切的載體pYeDP60 中，獲得含全長 Dsred 基因的 pYeDP60-Dsred 重組釀酒酵母表達載體，并進行測序鑒定。載體構建過程實驗步驟參考快速連接試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 重組表達載體的轉化和誘導表達 采用LiAc 法[17]將測序鑒定正確的 pYeDP60-Dsred 重組表達載體轉化至釀酒酵母菌 W303-1B，取轉化產物涂布在固體 SC-Ade-Ura 培養基上，28 ℃ 培養 3 ～ 4 d 后，挑取 3 個轉化子分別接種至 10 ml液體 SC-Ade-Ura 培養基，28 ℃ 培養 2 ～ 3 d。取3 ml 菌液，利用酵母質粒提取試劑盒提取質粒，以提取質粒為模板，Fyedp60Red、Ryedp60Red 為上下游引物，進行 PCR 擴增篩選陽性克隆，獲得的陽性克隆命名為 W303B[pYeDP60-Dsred]。

挑取陽性克隆接種至 10 ml 液體 SC-Ade-Ura培養基，28 ℃ 培養 2 ～ 3 d 后，取 1 ml 菌液轉接至 50 ml 新鮮的液體YPG酵母誘導培養基中，28 ℃ 誘導 24 h。取 1 ml 樣品，同時以轉化入pYeDP60 空載體的重組菌株 W303B[pYeDP60]作為空白對照，12 000 × g 離心 1 min，棄上清，取沉淀進行 SDS-PAGE 電泳。

1.2.4 表達產物鑒定 取誘導表達 24 h 的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌，12 000 × g 離心 1 min后收集菌體，去離子水洗滌 1 次后加入伴刀豆球蛋白（1 mg/ml）懸浮，涂于載玻片上，在 Eclipse 80i正置熒光顯微鏡下觀察綠光激發后的熒光成像。

1.2.5 重組蛋白對釀酒酵母生長的影響 將鑒定正確的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分別接種至 YPD、YPG、SCG、SCD 培養基，培養 48、72、96、120、144 h 后分別取樣，利用酶標儀測定波長600 nm 處酵母菌細胞的吸光度（A600）值，觀察重組 Dsred 蛋白對釀酒酵母菌生長的影響。

1.2.6 重組蛋白表達特性的分析 取誘導表達24 h 的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌液 15 ml，分裝入 15 管，每管 1 ml。實驗分 3 組，每組5 管，分別進行如下處理：第 1 組保持菌液狀態（菌液組）；第 2 組 12 000 × g 離心 1 min 后收集菌體，加入甘油后混懸（高滲組）；第 3 組12 000 × g 離心 1 min 后收集菌體（菌體組）。處理后將每組 5 管分別置于 –70、–20、4、28、37 ℃條件培養，每 24 h 取樣 1 次進行熒光觀察。

2 結果

2.1 Dsred基因克隆

連續重疊 PCR 擴增產物經 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析，結果獲得長為 678 bp 的特異性條帶（圖 1）。將擴增產物與 pMD-18T 連接，獲得的pMD-Dsred 重組載體測序結果表明，擴增獲得的

圖 1 Dsred 基因連續重疊 PCR 擴增結果Figure 1 The successive overlap PCR products of Dsred gene

圖 2 pYeDP60-Dsred 重組表達載體圖譜Figure 2 Map of recombinant expression vector pYeDP60-Dsred

圖 3 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌 PCR 擴增篩選結果Figure 3 PCR amplification screening of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]

Dsred 基因與已經發表的基因序列完全一致。

2.2 重組表達載體的構建

采用 In-fusion 方法快速連接獲得的 pYeDP60-Dsred 重組表達載體經測序鑒定顯示，克隆的Dsred 基因序列完全正確，表明目標基因已成功插入重組表達載體，且 Dsred 基因表達受酵母誘導型啟動子 GAL10-CYC1 調控，與理論設計完全相符（圖 2）。

2.3 工程菌的篩選與誘導表達

將 pYeDP60-Dsred 重組表達載體轉化至釀酒酵母菌 W303-1B 后進行擴大培養，挑取 3 個克隆提取質粒進行 PCR 擴增，結果顯示 3 個克隆均擴增獲得了長為 700 bp 的特異性條帶，表明挑取的 3 個克隆均為陽性克隆，含有 Dsred 基因（圖 3）。

挑取陽性克隆進行誘導培養，SDS-PAGE 分析顯示，誘導后工程菌的表達產物可見相對分子質量為 28 kD 的特異性蛋白條帶，與預期蛋白相對分子質量相符（圖 4）。

2.4 表達產物鑒定

圖 4 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌誘導表達產物的SDS-PAGE 分析Figure 4 SDS-PAGE analysis of expression products of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]

W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌經誘導培養24 h 后置于熒光顯微鏡下觀察，可見在綠光激發下，W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌被激發出紅色熒光，表明構建的 pYeDP60-Dsred 重組表達載體可成功在釀酒酵母菌體內正常表達（圖 5）。

2.5 重組蛋白對釀酒酵母菌的影響

將 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分別接種至 SCG、SCD、YPG、YPD 培養基，培養 48 h 后連續測定 A600值，結果顯示抑制 pYeDP60-Dsred表達的 SCD、YPD 培養基與可誘導 pYeDP60-Dsred 表達的 SCG、YPG 培養基內釀酒酵母菌體生長無明顯差別（圖 6），表明重組 Dsred 紅色熒光蛋白表達對釀酒酵母菌體的生長影響很小，對釀酒酵母菌無毒性，不會抑制其生長。

2.6 高滲環境中重組蛋白的表達特性

W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌經不同處理后，熒光顯微鏡下連續觀察各組紅色熒光蛋白的表達成熟時間，結果顯示在不同溫度條件下，高滲組紅色熒光蛋白的成熟時間均最短，菌液組時間最長，且持續時間較短。在 37 ℃ 條件下培養時紅色熒光蛋白成熟最早，然而也最不穩定，熒光蛋白降解速度較快；在 4 ℃ 條件下培養時紅色熒光蛋白成熟時間雖然遲于 37 ℃，但最穩定（表2）。

3 討論

紅色熒光蛋白是一種標記分子，由于其激發和發射波長更長，細胞穿透力更強以及細胞毒性小而被廣泛應用到基因表達與調控[18-19]、分子標記[11-13]和蛋白相互作用[14-16]等領域。釀酒酵母菌是一種模式真核生物，以釀酒酵母菌為宿主的多種研究蛋白相互作用的技術，如酵母雙雜交[20-21]和酵母雙分子熒光互補技術[14-16]等也都已經建立成熟。為了更好地將紅色熒光蛋白應用至釀酒酵母菌為宿主的技術中，我們對紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌內的異源表達進行了實驗研究，SDS-PAGE 和熒光顯微鏡觀察結果表明，pYeDP60-Dsred 重組表達載體已成功構建和轉化，并可正常在釀酒酵母菌體內表達，為紅色熒光蛋白的應用奠定理論基礎。

圖 5 W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌重組Dsred紅色熒光蛋白表達的熒光顯微鏡觀察（A：W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌相差結果；B：W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌綠色熒光激發結果；C：釀酒酵母菌W303B相差結果；D：釀酒酵母菌W303B綠色熒光激發結果）Figure 5 Fluorescent microscope images of recombinant Dsred red fluorescent protein expressed by the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]. (A: Phase contrast image of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]; B: Image of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred] excited by green fluorescence; C: Phase contrast image of Saccharomyces cerevisiae W303B; D:Image of Saccharomyces cerevisiae W303B excited by green fluorescence)

圖 6 重組Dsred紅色熒光蛋白對釀酒酵母菌生長的影響Figure 6 Effect of recombinant Dsred red fluorescent protein to Saccharomyces cerevisiae growth

表 2 不同條件下重組Dsred紅色熒光蛋白的成熟時間Table 2 The mature time of recombinant Dsred red fluorescent protein treated with different conditions

為了進一步探究 pYeDP60-Dsred 重組表達載體對釀酒酵母菌生長的影響，我們將 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分別接種至 SCG、SCD、YPG、YPD 培養基中進行連續培養觀察。由于pYeDP60-Dsred 重組表達載體中 Dsred 基因受GAL10-CYC1 啟動子調控表達，而 GAL10-CYC1啟動子是一種半乳糖誘導、葡萄糖抑制型啟動子，因此 SCG 和 YPG 培養基中 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌在半乳糖的誘導下，可產生重組Dsred 蛋白；但作為對照，SCD 和 YPD 培養基中W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌表達則受到抑制，無法產生重組 Dsred 蛋白。本實驗結果顯示誘導表達的工程菌與抑制表達的工程菌生長情況基本一致，紅色熒光蛋白表達對釀酒酵母菌體生長無明顯影響。

高滲透壓環境是酵母細胞在生長繁殖過程中經常遇到的脅迫現象之一，因此了解高滲透壓環境下紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌內的表達特性具有重要意義。在長期的生物進化過程中，酵母逐步形成了抵抗外界脅迫環境的生理機制，即通過促進一種或多種特殊溶質（相容性溶質）在細胞內的累積從而調節細胞內滲透壓的平衡。這些相容性溶質能在細胞內以高濃度存在而不對細胞內酶產生抑制或失活作用，甘油即為釀酒酵母菌和多種其他酵母菌細胞最主要的一種相容性溶質。本研究通過對菌液進行離心、加入甘油等處理，使釀酒酵母菌處于一種少水的高滲透環境中，結果表明高滲透壓環境能夠明顯縮短釀酒酵母菌內紅色熒光蛋白的成熟時間，并使其長期保持穩定。由此可得出結論，離心保留菌體和加入甘油等缺水處理都有利于紅色熒光蛋白的成熟。

自從紅色熒光蛋白被發現以后，各國科學家都通過對紅色熒光蛋白進行體外分子進化，獲得了多種成熟時間縮短的突變體，卻很少有實驗涉及探討環境與成熟時間的關系。本實驗通過研究紅色熒光蛋白在高滲環境中的表達特性，證實除分子進化之外，通過改變紅色熒光蛋白在宿主內所處的環境，也能顯著地縮短其成熟時間，保持其穩定性，進一步拓寬了紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌研究領域的應用。

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