非小細胞肺癌分子靶向治療中EGFR-TKI的耐藥機制研究進展

李媛 綜述 宋麗華 審校

目前肺癌已成為全世界最常見的惡性腫瘤，其死亡率已居世界首位。肺癌中約80%-85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），手術是治療肺癌最有效的方法，但是大多數患者在確診時已為晚期期而失去手術機會。以鉑類為基礎的化療藥物對NSCLC的治療療效雖有提高，然而這種療法似乎進入了一個平臺期，無法滿足進展期NSCLC的治療需要。近年來，腫瘤分子靶向治療成為全球研究的熱點之一，以吉非替尼（gefitinib, iressa）和厄洛替尼（erlotinib, tarceva）為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）在NSCLC治療中發揮了重要作用。但是在臨床中，有些患者對EGFR-TKIs的治療并不敏感，或開始對該類藥物高度敏感但經過約10個月-14個月[1,2]的中位無疾病進展生存期（progression free survival, PFS）后最終產生耐藥，使該類藥物的臨床應用受到一定限制。闡明EGFR-TKIs的有效機制、原發性耐藥機制和治療有效后的繼發性耐藥（獲得性耐藥）機制，將有助于高選擇性個體化治療，為克服或逆轉耐藥提供新思路。本文將對近年來EGFRTKIs耐藥機制的研究進展作一綜述。

1 EGFR結構及功能

EGFR是跨膜受體酪氨酸激酶家族的一員，該家族共4個成員，包括HER1（erbB1, EGFR）、HER2（erbB2）、HER3（erbB3）及HER4（erbB4），由3個不同的結構區組成，包括胞外配體結合區、跨膜區和胞內酪氨酸激酶區。EGFR可以與特異性配體如表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、轉化生長因子α（transforming growth factor α, TGF-α）、雙向調節蛋白（AR）等結合形成同源二聚體，也可以和HER2或其它家族成員形成異源二聚體。二聚體的形成使蛋白質構象發生改變，導致酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）激活及受體自動磷酸化，從而激活下游一系列信號轉導通路，如Ras-Raf-MAPK途徑、PI3K-Akt途徑和STAT途徑。EGFR信號通路在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發揮重要的作用，而在一些腫瘤細胞中EGFR常過表達，與腫瘤細胞的轉移、侵潤、預后差有關。

2 EGFR突變與EGFR-TKIs作用機制

肺癌中EGFR突變主要發生在胞內酪氨酸激酶編碼區（18-21外顯子），這些突變多存在于ATP結合裂隙附近，而該位點正是吉非替尼結合的靶位。其中最常見的有2種突變形式，占目前所有檢測出來突變的80%-90%，分別為：①19外顯子第746-750位密碼子的缺失突變，導致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，改變了受體ATP結合囊角度；②21外顯子點突變（L858R），此突變位點緊鄰激酶活化環中高度保守的模體，兩種突變均明顯增強了腫瘤細胞對EGFR-TKIs的敏感性。臨床研究顯示：亞裔、女性、非吸煙、腺癌患者對EGFR-TKIs顯示較好的療效，且與EGFR突變分布一致。EGFR突變后對TKIs的反應率增高的可能解釋有2種，一種是癌基因依賴學說，EGFR突變的腫瘤對EGFR這條信號通路高度依賴，所以阻斷這條通路對腫瘤生長影響很大，從而提高了抗腫瘤藥物的療效。另一種可能是突變導致關鍵氨基酸殘基重新分布，使得EGFR不管與ATP還是TKIs結合都更為緊密，這可以解釋突變的EGFR與配體結合酪氨酸激酶活性增強，同時與TKIs結合后TK活性抑制也較強。

3 EGFR-TKIs耐藥機制

3.1 原發性耐藥 原發性耐藥即腫瘤細胞在治療初期就對TKIs治療無明顯反應，應用該藥物治療后病情未得到緩解，臨床未明顯獲益。EGFR基因的突變率因種族的不同而不同，在亞洲NSCLC患者中高達20%-30%，而在高加索NSCLC患者中為10%-15%[3]。臨床研究[4]證實，EGFR突變陽性的NSCLC對吉非替尼或厄洛替尼的治療有效率為70%-80%，而野生型患者的有效率僅約10%-20%，因而，不少患者對EGFR-TKIs治療存在著原發性耐藥，而EGFR不同的基因狀態可能存在著不同的原發性耐藥機制。研究顯示某些EGFR突變也可以引起NSCLC對EGFR-TKIs耐藥，如治療前存在EGFR 20外顯子插入突變提示原發性耐藥[5]，其機制可能是由于突變形成了空間位阻，使吉非替尼及厄洛替尼無法與TKs區結合，大大地降低了藥物的敏感性。

但是上述突變較少見，只能對原發性耐藥做出部分解釋。EGFR突變的NSCLC對EGFR信號通路高度依賴，稱為EGFR依賴或成癮，當應用EGFR抑制劑時，這些通路被關閉而發生凋亡，然而EGFR野生型的NSCLC中沒有此EGFR依賴來調控下游信號通路，可能伴有其它信號通路的異常，因此對EGFR-TKIs不敏感。研究[6]發現大約有10%-30%的NSCLC患者存在KRAS基因突變，這些突變與吸煙之間具有很強的相關性，而EGFR突變卻常常發生在非吸煙者的亞裔患者中，這些數據說明KRAS和EGFR突變很少同時出現在同一類型的腫瘤中。另有研究[7]顯示KRAS突變與EGFR突變互相排斥，也就是說該突變大多存在于EGFR野生型腫瘤，這可能是導致EGFRTKIs原發性耐藥的另一重要機制。KRAS基因突變主要發生于第12、13位密碼子，這兩種密碼子主要發生G-T顛換，突變的結果導致編碼的氨基酸發生改變，持續性激活EGFR非依賴性信號通路，導致瘤細胞增殖、轉移以及凋亡抵抗，進而對EGFR-TKIs產生原發性耐藥。KRAS突變在高加索人群NSCLC患者的突變率較高[8]，尤其是在肺腺癌患者中突變率達30%-50%，而EGFR的突變率較低（3%-8%），這可能是高加索人群對TKIs原發性耐藥發生率較高。BR.21安慰劑對照試驗[9]對KRAS與EGFR基因型對厄洛替尼治療效果的影響進行了評估，結果顯示，KRAS野生型患者（HR=0.69, P=0.03）可從厄洛替尼治療中獲得統計學意義上的生存益處，而KRAS突變型（HR=1.67, P=0.31）生存獲益則未達到統計學意義。Sasaki等[10]分析研究了172例日本NSCLC患者的KRAS突變及其基因拷貝數的聯系，以及與生存期的關系，結果顯示僅KRAS突變與肺癌患者的生存期有關，KRAS突變及其基因拷貝數增加導致患者預后不良。因此，以上研究提示KRAS基因突變與肺癌患者對EGFR-TKIs的原發耐藥有關，利用KRAS基因檢測可以為TKIs藥物治療病人的篩選提供重要參考。

KRAS信號途徑的其它信號分子可能與EGFR-TKIs的原發耐藥有關，如BRAF（Raf亞型）突變。BRAF基因是RAF家族的成員之一，該家族還包括ARAF和RAF1。BRAF編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學過程，如細胞增殖、分化和凋亡等，與腫瘤的發生關系密切。研究表明約3%的NSCLC存在BRAF突變，最常見的BRAF突變發生在BRAF激酶區活性部分的600位，由谷氨酸取代了纈氨酸（V600E），突變可激活MEK-ERK信號傳導通路，誘導細胞增殖和分化。BRAF突變的NSCLC對EGFR信號通路缺乏依賴性，故對EGFRTKIs有耐藥性，而對MEK抑制劑敏感[11]。因此，應用靶向BRAF及整個RAF家族或它的效應器（如MEK）的藥物，可對部分BRAF突變患者臨床獲益。

另外有研究[12]結果表明，棘皮動物微管相關蛋白樣4（EML4）/間變淋巴瘤激酶（ALK）融合基因（EML4-ALK融合基因）與TKIs耐藥有關，約3%-5%的NSCLC患者可發現EML4-ALK基因重排，EML4-ALK基因重排常導致異常酪氨酸激酶表達。2009年Shaw等[13]分析了141例NSCLC患者EML4-ALK的突變情況，發現19例患者存在EML4-ALK突變（13%），這些多為不吸煙或輕度吸煙及腺癌患者，且EML-ALK陽性患者通常對TKIs治療無效。因此需要轉變對這部分患者的治療策略，例如針對ALK的靶向治療。

EGFR-TKIs原發性耐藥也可能與非突變機制介導有關。在體外實驗收集的資料[14]表明Met激活與EGFR-TKIs原發性耐藥有關，與MET原癌基因擴增是相互獨立的，實驗還發現在原發腫瘤患者中Met的表達及磷酸化作用是發生腦轉移的高危因素。與獲得性耐藥作用不同，原發耐藥主要是由HGF激活MET通過GRB2相關結合蛋白1（GAB1）的作用激活下游信號通路[15]，而不是ErbB3的作用。

3.2 EGFR-TKIs的獲得性耐藥 獲得性耐藥即在治療初期效果顯著，經過幾個療程后對藥物反應性下降，最終出現腫瘤復發或進展的情況。2010年Jackman等在J Clin Oncol雜志[16]上發表了關于EGFR-TKIs獲得性耐藥的定義：①既往接受過EGFR-TKIs單藥治療（吉非替尼或厄洛替尼）；②符合以下標準之一：具有與藥物敏感性相關的EGFR基因突變（如G719X、19外顯子缺失、 L858R、L861Q）；接受EGFR-TKIs單藥治療后有客觀上的臨床獲益，包括完全緩解、部分緩解或是超過6個月的疾病穩定（依照RECIST或WHO標準）；③接受吉非替尼或厄洛替尼連續治療至少30天后出現疾病進展（RECIST或WHO標準）；④停用EGFR-TKIs及開始新的治療方法之間無其它系統治療。現有的研究顯示，約50%的EGFRTKIs獲得性耐藥與T790M突變相關，另有20%與原癌基因MET擴增相關，而一些獲得性耐藥的分子機制目前仍在研究中。

3.2.1 T790M突變 EGFR二次突變是第一個被國際上認可的引起EGFR-TKIs獲得性耐藥的機制，率先由Kobayashi等[17]2005年發表在N Engl J Med上的文章提出。該研究對1例治療前有EGFR 19外顯子敏感活化突變（del L747-S752）、接受吉非替尼二線治療達完全緩解24個月后出現進展的肺腺癌患者進行二次活檢，分析其活檢組織EGFR基因突變情況，發現在原有突變基礎上，EGFR基因發生了第二次突變，突變位點在20外顯子，即酪氨酸激酶活化域的790位蘇氨酸殘基被甲硫氨酸取代，從而形成位阻效應，在空間上阻礙了吉非替尼和厄洛替尼的連接。近年來的研究[18]顯示，T790M突變增加了EGFR與ATP之間的親和力，相對削弱了與EGFR-TKIs的親和力。因此針對T790M突變導致TKIs耐藥的NSCLC，可給予不可逆性的多靶點抑制劑作為后續治療。

T790M突變是怎樣產生的呢？為了說明這一問題，2006年Inukai等[19]用一種使T790M突變富集的高敏感性PCR檢測方法，從280例未經吉非替尼治療的NSCLC患者中發現9例T790M突變（3.6%），而用直接測序方法僅檢出1例，據此作者提出了假說：經過EGFR-TKls治療后敏感腫瘤細胞被殺滅，而其有T790M突變的耐藥腫瘤細胞則被選擇性存活下來。Maheswaran等[20]通過用一種高敏感的PCR方法，對26例具有EGFR突變的NSCLC患者外周血循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）及腫瘤組織進行了分析，有10例在血液中檢測出了具有T790M突變的腫瘤細胞（38%），且只有以很高的擴增循環數才能檢測到，發現該突變不僅存在于接受EGFR-TKIs治療的患者腫瘤細胞中，還存在于治療前的腫瘤組織中，突變表明PFS持續時間更短。以上研究結果表明，T790M突變在未經EGFR-TKIs治療的腫瘤細胞中有微克隆存在，治療過程中這些克隆被選擇性富集。

3.2.2 MET擴增 原癌基因MET擴增是導致EGFR-TKIs獲得性耐藥性的另一重要機制。MET是肝細胞生長因子（HGF）/分散因子的一種高親和力的酪氨酸激酶受體，被激活后發生自身磷酸化，引起多種底物蛋白磷化和細胞內一系列信號傳導，激活MAPK-ERK1/2及P13K-Akt等信號通路，促進多種瘤細胞的生長、侵襲和轉移。2007年Engelman等[21]構建了一株開始對吉非替尼敏感的但暴露在遞增濃度的吉非替尼6個月后產生對其耐藥的克隆的細胞株，結果發現這一耐藥歸因于MET原癌基因的擴增。研究者提出MET擴增導致的吉非替尼耐藥是通過以ErbB3介導的PI3K通路持續激活，從而繞過了受抑制的EGFR靶點而產生。

由于MET擴增可促進TKIs耐藥性的產生，多個MET抑制劑正在研究中，如HGF抗體（AMG102）、MET抗體（MetMAb）及MET小分子抑制劑（XL184、ARQ 197、SGX-523等）。其中ARQ197是一種選擇性的METTKIs，應用于晚期NSCLC的II期臨床研究[22]顯示，厄洛替尼+ARQ197組的PFS為16.1周，而厄洛替尼+安慰劑組為9.7周。聯合EGFR-TKIs和c-MET抑制劑可能延緩耐藥，但有待進一步研究結果證實。

3.2.3 其它機制 對TKIs獲得性耐藥的患者，約30%-40%既無繼發突變，也無MET擴增，這些患者耐藥機制的研究還在進行中。可能的機制如下：

腫瘤細胞從上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT)，是生物胚胎形成和發育常見的生理過程，同時還存在于多種病理過程中，與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移有著密切的關系。EMT以上皮標記物蛋白（如E-鈣粘蛋白、EpCAM等）的下調及間葉標記物蛋白（如波形蛋白、纖連蛋白等）的上調為特征。研究[23]發現，當發生EMT的肺癌重新表達E-鈣粘蛋白后，腫瘤細胞可恢復對EGFR-TKIs治療的敏感性。Yauch等[24]收集了87例化療聯合厄洛替尼治療后復發的肺癌患者，對其中的65例進行分析后發現，E-鈣粘蛋白高表達的患者PFS更長（HR=0.37），而對厄洛替尼不敏感的肺癌組織往往合并波形蛋白和（或）纖連蛋白等標記物的表達。以上研究提示EMT狀態可作為預測EGFRTKIs療效的潛在因素，這仍需進一步研究確定是否有臨床意義[25,26]。

胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）是一種跨膜蛋白，在致癌性轉化、腫瘤細胞生長和存活起到非常重要的作用。有研究[27]指出，EGFR-TKIs可誘導NSCLC細胞膜表面EGFR/IGF1R異源二聚體化進而激活IGF-1R及其下游信號通路MAPK和P13K/AKT的轉導，并能刺激mTOP介導的survivin蛋白合成引發抗凋亡效應，從而引起肺癌患者對TKIs耐藥。 另一項體外研究[28]顯示，對吉非替尼耐藥的細胞株中，IGF結合蛋白3（IGFBP3）及IGF結合蛋白4（IGFBP4）表達下調，與IGF-1R及其下游信號通路轉導的激活有關。EGFR高表達的樣本中也伴隨著IGFR-1的高表達，因此EGFR和IGF-1R雙靶點抑制劑可作為潛在的治療策略。

另外EGFR-TKIs獲得性耐藥也與以下幾個方面有關：①研究發現PTEN基因表達喪失可活化PI3K/Akt/mTOR信號通路，導致凋亡抵抗，促進癌癥的發生，進而對EGFR-TKIs產生耐藥[29-31]；②有報道[32]腫瘤細胞微環境改變與獲得性耐藥有關，可能與TGF-β及IL-6的分泌有關；③EGFR-TKIs可誘導FGFR2和FGFR3信號通路，從而引發對其產生快速的獲得性耐藥[33]，聯合應用EGFR和FGER酪氨酸酶抑制劑，可逆轉TKIs耐藥；④近來有研究報道[34]，EGFR野生型患者中BCRP/ABCG2高表達可對吉非替尼產生獲得性耐藥。細胞信號傳導過程復雜，具有多向性，因此對EGFR-TKIs耐藥機制的研究仍是當前靶向治療領域的探索熱點。

4 展望

EGFR-TKIs雖然在晚期NSCLC治療中發揮了重要作用，但其原發與獲得性耐藥問題已經成為限制其療效進一步提高的瓶頸，因此對其耐藥機制的深入研究，尋找克服耐藥的治療方法，已經成為腫瘤研究領域的迫切任務。隨著基礎研究和臨床實驗的不斷深入，EGFR-TKIs藥物耐藥機制逐漸清晰，越來越多的針對腫瘤耐藥機制或作用于其它相關信號通路的靶向藥物逐漸進入臨床，并取得一定療效。

目前針對EGFR-TKIs耐藥問題，臨床治療策略主要涉及以下方面：①研究發現不可逆的EGFR-TKIs可用于對抗有EGFR突變的NSCLC患者的吉非替尼和厄洛替尼的耐藥性。與可逆性TKIs不同的是，不可逆的EGFR-TKIs與EGFR TK區永久性結合；②“旁路激活途徑”在EGFRTKIs耐藥中發揮重要作用，腫瘤細胞信號傳導相互交錯，單靶點藥物不能阻斷腫瘤細胞所有信號轉導，因此開發多靶點的靶向治療藥物成為新的研究趨勢[35]；③某些生物學分子標記物與EGFR-TKIs療效相關。為使EGFRTKIs的臨床應用更為合理有效，需確定有效的預測靶標及最佳的檢測方法，選擇適合的患者接受TKIs治療，進一步提高NSCLC的療效和生存，最大限度地避免無效的治療。隨著對EGFR-TKIs原發性和獲得性耐藥機制的不斷深入探討，與EGFR-TKIs療效有關的分子生物標記及其之間的相互關系必將越來越明了，有望使個體化治療更上一個臺階。