MiRNA作為肺癌分子診斷工具的前景與挑戰

丁燕 南娟 翻譯 曹志成 校對

1天津醫科大學總醫院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與腫瘤微環境重點實驗室；

2香港特別行政區 伊利沙伯醫院 臨床腫瘤科

“在過去的十年里，miRNA已成為調節基因表達的關鍵分子之一。它幾乎涉及肺癌癌變的每一個進程，包括腫瘤進展、血管新生、侵襲和轉移。”

肺癌是最主要的惡性腫瘤類型，也是全球男性癌癥死亡率最高的疾病。對于女性來說，肺癌為第四位最常見惡性腫瘤，其死亡率更高居癌癥第二位[1]。肺癌預后不良，主要原因為診斷時多為晚期且易復發。通過可靠的早期診斷和預后標志物的應用，全球部分肺癌負擔或可得以減輕。。

在過去的十年里，miRNA已成為調節基因表達的關鍵分子之一。它幾乎涉及肺癌癌變的每一個進程，包括腫瘤進展、血管新生、侵襲和轉移[2]。miRNA芯片的廣泛綜合利用或可識別一些可作為潛在腫瘤標志物的miRNAs[3]。近幾年來，一些研究已經有效地研發出用于肺癌分子診斷的miRNA生物標志物[4]。本文將探索miRNAs作為肺癌生物標志物的最新研究，并將討論該熱點研究領域的前景與挑戰。

miRNAs在肺癌風險評估中的作用

在人類基因組中單核苷酸多態性是最常見的遺傳變異，它們有助于癌癥風險的評估[5]。一項meta分析探討了hsa-miR-196a2rs11614913多態性與癌癥風險的關系。研究發現攜帶TC/CC基因型的個體較攜帶TT的個體患肺癌風險高。該研究結果提示hsa-miR-196a2rs11614913多態性的變異或使個體對肺癌更為易感[6]。

肺癌早期發現與診斷

通過特定miRNA表達的檢測，發展中的肺癌或可先于診斷前數年被發現。在眾多樣本類型中，因為血液易于通過輕微創傷性方式收集，故對于腫瘤生物標志物檢測來說血液為理想的樣本類型。研究發現與對照組相比，在早期非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）的血清樣本中hsa-miR-1254和hsa-miR-574-5p的表達明顯升高。上述兩個miRNAs的異常表達可先于臨床診斷前數月被檢測到，敏感性為82%，特異性為77%，可作為篩查與早期診斷的有效生物標志物[7]。通過基于Taqman探針的定量反轉錄（reverse transcription,RT）-PCR和風險評分分析，一組由10個miRNAs（miR-20a、miR-24、miR-25、miR-145、miR-152、miR-199a-5p、miR-221、miR-222、miR-223和miR-320）組成的血清譜亦可準確分辨出NSCLC臨床診斷前33個月收集的血清樣本。其在非小細胞肺癌檢測的曲線下面積、敏感性和特異性分別為0.97、0.93和0.90[8]。

“通過特定miRNA表達的檢測，發展中的肺癌或可先于診斷前數年被發現。在眾多樣本類型中，對于腫瘤生物標志物檢測來說，血液為理想的樣本類型?！?/h2>

從肺癌患者血清中鑒定的miRNA標志物中，聚類分析和自組圖譜已識別出一個包含大部分可預測樣本的集群。相關性分析顯示miRNA表達譜最明顯的變化似乎發生在接近診斷的某個時間[9]。通過研究早期NSCLC患者和匹配的對照人群的配對血清標本，一個研究小組發現NSCLC患者血清中miR-146b、miR-221、let-7a、miR-155、miR-17-5p、miR-27a和miR-106a的表達明顯降低，而miR-29c的表達卻明顯升高[10]。另有一項調查研究評估了與良性腫瘤患者相比肺癌患者血清中miRNAs的臨床相關性。與良性腫瘤患者相比，肺癌患者中miR-10b、miR-141和miR-155的水平明顯升高。而且，他們發現血清中miR-10b的高表達和淋巴結轉移有關[11]。

研究發現螺旋計算機斷層掃描（c o m p u t e d tomography, CT）是診斷無癥狀肺癌的一個有效的檢測方法。借助一項通過每年一次的低劑量螺旋CT對高危人群進行篩查以發現肺癌的大型研究，建立了一個多因素風險預測34-miRNA模型，無癥狀高風險人群診斷為I期NSCLCs的曲線下面積為0.89。這種血清檢測或可用于高危人群早期NSCLC的篩查中[12]。

肺癌預后和預測的miRNA標志物

為了避免不必要的治療和增強CT篩查對死亡率的影響，侵襲性疾病生物標志物的識別對于定義高風險病變的臨床有效預測性標志物至關重要。檢測CT篩查發現腫瘤發生前收集到的血漿樣品的miRNA表達譜，由9個不同miRNAs（miR-221、miR-660、miR-486-5p、miR-28-3p、miR-197、miR-106a、miR-451、miR-140-5p和miR-16）組成的10個表達比率正確地識別了伴有侵襲性疾病的肺癌患者。該標志物的敏感性為80%，特異性為100%。這些miRNA生物標志物可能有助于避免低風險惰性疾病的過度治療以及高風險轉移性疾病的延誤診斷。

另一方面，預測生存期的分子生物標志物的發現和應用也可改善肺癌患者的治療。研究發現I期NSCLC患者血清中miR-223表達的降低與預后較差密切相關[10]。對I-IIIA期肺癌患者進行全基因組Solexa研究，之后進行三套獨立的定量RT-PCR評估，發現血清中miR-486、miR-30d的高表達以及miR-1、miR-499的低表達與NSCLC的不良生存相關。這四個miRNAs在血清中的表達或可作為NSCLC患者總生存期的無創性預測性標志物[14]。

越來越多的證據表明肺腫瘤組織中miRNA表達的改變也與腫瘤進展和患者的生存相關。miRNAs的沉默是肺癌變的常見事件，而癌組織中的DNA甲基化在激活肺癌表觀遺傳miRNAs沉默中起重要作用。一項詳細的DNA甲基化分析發現41%的原發性NSCLC病例伴有miR-34b甲基化，而且一項多因素分析表明miR-34b甲基化與淋巴浸潤顯著相關。因此，該miRNA的DNA甲基化可作為肺癌侵襲性表型的生物標志物[15]。就侵襲而言，腦轉移（brain metastasis, BM）在NSCLC患者中很常見。使用miRNA微陣列分析和定量RT-PCR分析，研究發現miR-328和miR-330-3p的聯合能夠正確區分BM陽性和BM陰性的NSCLC患者，準確率達80%（敏感性為0.75，特異性為0.82）。這兩個miRNAs或可用于臨床治療決策以區分BM高風險的NSCLC患者[16]。

“肺癌組織分析也表明miRNAs可作為肺癌分類、預后分層和藥物反應預測的有效分子標志物。”

miR-21在多種癌癥類型中是致癌性miRNA。通過定量RT-PCR檢測NSCLC患者組織中的miRNAs表達，研究發現miR-21的高表達與I期肺腺癌患者的疾病進展呈正相關，與無復發生存呈負相關。該miRNA可作為肺腺癌的早期預后生物標志物[17]。另一方面，研究認為miR-126與腫瘤血管新生和VEGF-A有關。通過高通量組織芯片、原位雜交和免疫組織化學方法檢測I-IIIA期NSCLC患者切除的腫瘤組織樣本， 發現miR-126和VEGF-A的共表達對5年生存率具有顯著的預后影響。研究認為在NSCLC中該miRNA是一個強且獨立的負性預后因素[18]。

NSCLC患者的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的敏感性密切相關。我們的初步研究發現，miR-145的上調是控制肺腺癌細胞增殖的一個重要的基因調控機制，且與EGFR的下調密切相關。miR-145作為EGFR-TKI作用的預測性生物標志物值得進一步研究，并有可能促進肺腺癌患者的個體化EGFR-TKI治療[19]。

結論與挑戰

miRNA標志物發現的日益增加為癌癥分子診斷提供了令人鼓舞的機會[20]。肺癌患者血液中miRNAs標志物的鑒定正在快速開展，這可能對無創性早期診斷和隨訪觀察有一定價值。肺癌組織分析也表明miRNAs可作為肺癌分類、預后分層和藥物反應預測的有效分子標志物。

盡管近年來肺癌中miRNA標志物的鑒定取得了可喜的成果，但仍無一標志物得以進入臨床階段。大多數用于早期檢測的標志物的敏感性和特異性水平似乎還不盡人意，miRNA表達分析的檢測和定量技術也需要改善。用于區分早期惡性和非惡性腫瘤的miRNA標志物有待大力發展。沒有臨床易用并經濟有效的miRNA檢測技術，miRNAs就不能直接影響肺癌的治療。

對于肺癌的預后和預測性標志物，盡管在眾多研究中病例與對照組之間存在明顯的統計學差異，這些令人振奮的結果應用到臨床實踐仍需要合理的驗證。充分認識并定義常規程序、標準以及質控從而將寶貴的實驗結果轉化為肺癌患者的臨床相關程序非常必要。須特別關注的是用以解決標志物的臨床問題的周密的系列設計和大型多中心臨床試驗的執行。如果設計嚴謹且嚴格遵守良好的臨床實踐，這些試驗有可能會使新興的生物標志物用于臨床實踐。到底miRNA標志物能否轉化為肺癌的臨床實踐，結論為時過早，但大量的有關miRNAs用于肺癌篩查、預后和監測抗癌治療療效的潛在應用的信息無疑已經涌現。

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