赤芍、白芍涼血作用比較研究(Ⅰ)-LPS刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的作用研究

宋玉超 連超杰 崔秀榮 李 強(qiáng)* 雷海民

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

赤芍、白芍涼血作用比較研究(Ⅰ)-LPS刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的作用研究

宋玉超 連超杰 崔秀榮 李 強(qiáng)* 雷海民

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 觀察赤芍、白芍各醇提物對脂多糖（LPS）致大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）不同時(shí)間段活性的影響，比較赤芍、白芍各醇提物的涼血作用的異同。方法 采用四甲基偶氮唑鹽比色 （MTT）法檢測LPS（1μg/mL）對NR8383細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率及赤芍、白芍（10μg/mL）對LPS誘導(dǎo)NR8383活性的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果 1μg/mLLPS刺激NR8383 6h之前抑制率為負(fù)值之后逐漸轉(zhuǎn)為正值，即先誘導(dǎo)其過度激活后促進(jìn)其凋亡；觀察到川赤芍、赤芍、白芍給藥組能夠在3h時(shí)顯著抑制NR8383的過度活化，與LPS對照組比較具有顯著差異（P＜0.05）；24h時(shí)各藥物組均能夠顯著抑制NR8383的異常凋亡，與LPS對照組比較具有顯著差異（P＜0.05）；24h時(shí)川赤芍、赤芍組與白芍組之間有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論 赤芍、白芍是在共同具有涼血功效的前提下有所偏重。

赤芍；白芍；脂多糖；大鼠肺泡巨噬細(xì)胞；細(xì)胞抑制率

2010年版《中國藥典》規(guī)定[1]：赤芍為毛茛科植物芍藥Peaonia lacti fl ora Pall.或川赤芍Peaonia Veitchii Lynch的干燥根，白芍為毛茛科植物芍藥Peaonia lactiflora Pall.經(jīng)去皮水煮后的干燥根。本實(shí)驗(yàn)為赤芍、白芍比較研究的一部分，觀察赤芍、白芍對LPS刺激NR8383不同時(shí)間段細(xì)胞活性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

川赤芍、赤芍、白芍均為自購，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定：川赤芍為毛茛科植物川赤芍Peaonia Veitchii Lynch的干燥根，赤芍、白芍分別為毛茛科植物芍藥Peaonia lacti fl ora Pall.未去皮和經(jīng)去皮水煮后的干燥根。

1.1.2 細(xì)胞

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系（NR8383）購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由本室傳代后使用。

1.1.3 試劑

LPS（sigma，D127：B8，L3129-10mg，LOT NO.：020M4062）；F12K培養(yǎng)基（GIBCO，500mL，LOT NO.：979454），雙抗（Hyclone，100mL，LOT NO.：J110981）和胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，100mL，LOT NO.：100419）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Amresco，50mg）；DMSO（Amresco，500mL，LOT#0640C354）

1.2 方法

1.2.1 川赤芍、赤芍、白芍醇提物的制備：將川赤芍、赤芍、白芍的干燥根粉碎，精密稱取25 g粉碎后的藥材，分別用8倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次2h，合并藥液，減壓濃縮干燥。精密稱取各提取物干粉100mg置10mL容量瓶中，加PBS稀釋至刻度，配成10mg/mL的原藥濃度，4℃保存?zhèn)溆茫吹么ǔ嗌执继嵛铩⒊嗌执继嵛铩咨执继嵛铩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：NR8383細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、青霉素（1×105U/L）、鏈霉素（100mg/L）、L-谷胺酰胺（2 mmol/L）、NaHCO3（1.5g/L）的Ham’s F12K培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.3 LPS對NR8383細(xì)胞活性分析：待NR8383細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，吹打消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，將該細(xì)胞液加入96孔板中，200μL/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后給予LPS溶液（LPS溶于PBS，終濃度分別為1μg/mL），正常細(xì)胞對照組加PBS。作用1h、3h、6h、12h、24h、36h后，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸盡液體后每孔再加入DMSO溶解液150μL，震搖5min，待紫色結(jié)晶全部溶解后，酶聯(lián)免疫檢測儀測A570值，計(jì)算LPS對NR8383的抑制率。

1.2.4 川赤芍、赤芍、白芍醇提物對LPS致NR8383細(xì)胞活性作用分析：細(xì)胞鋪板同1.2.3所示。實(shí)驗(yàn)設(shè)川赤芍、赤芍、白芍醇提物 （終濃度為10μg/mL）組，孵育1h，再加入LPS（1μg/mL）。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照（不用LPS刺激）組、LPS對照（LPS刺激后加入PBS）組。培養(yǎng)1h、3h、24h后，MTT法檢測A570值，計(jì)算各給藥組及LPS組對NR8383的抑制率。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用S-N-K檢驗(yàn)分析，結(jié)果用（±s）表示，P＜0.05為有顯著性差異，細(xì)胞抑制率（%）=1-藥物組/正常細(xì)胞對照組，設(shè)正常對照組抑制率為0%。

2 結(jié) 果

2.1 LPS對NR8383細(xì)胞活性作用分析結(jié)果

MTT法檢測的結(jié)果顯示，1μg/mLLPS刺激NR8383細(xì)胞后，在不同時(shí)間段呈現(xiàn)出截然相反的作用。即6h之前起到誘導(dǎo)NR8383細(xì)胞持續(xù)過度激活的作用，而6h之后卻又顯著地抑制其增殖，LPS對NR8383的抑制率24h達(dá)到最大值，之后有所降低，這與LPS對其損傷是可逆的相一致。LPS對NR8383抑制率結(jié)果見圖1。

圖1 MTT法檢測LPS對NR8383的抑制率

2.2 赤芍、白芍醇提取物對LPS所致NR8383細(xì)胞增殖作用結(jié)果

MTT法檢測的結(jié)果顯示，川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物組作用1h時(shí)，三組均不能拮抗LPS誘導(dǎo)NR8383過度活化，與對照組比較均無顯著差異（P＞0.05）；隨著作用時(shí)間的延長，至3h時(shí)川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物組都表現(xiàn)出拮抗作用，與LPS對照組比較均有顯著差異（P＜0.05），但三組之間無顯著差異（P＞0.05），這說明三者的作用效果相近；24 h時(shí)川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物組能夠拮抗LPS誘導(dǎo)NR8383過度凋亡，與LPS對照組比較均有顯著差異（P＜0.05）。同時(shí)，川赤芍組、赤芍組與白芍組之間也存在差異（P＜0.05），這說明白芍組作用效果較川赤芍、赤芍稍弱。而川赤芍組與赤芍組之間無差異（P＞0.05）。結(jié)果見圖2。

3 討 論

圖2 MTT法檢測川赤芍、赤芍、白芍醇提物組及LPS組對NR8383的抑制率

赤芍、白芍均具有活血化瘀的作用，但是“白補(bǔ)而赤瀉，白收而赤散”的理論使得二者在臨床上各自為藥，不可混用。然而從藥材基源看，明清之前，醫(yī)藥學(xué)家多以花和根的顏色來加以區(qū)別—花、根色白者謂之白芍，赤者謂之赤芍，可謂基源不清。當(dāng)代藥典中二者的基源也有相互交叉的部分，而且目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不足以體現(xiàn)二者在功效上的差異。需藥效實(shí)驗(yàn)補(bǔ)捉到功效成分的差異后,通過進(jìn)一步研究確定功效成分組,進(jìn)而有區(qū)別的制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),保證臨床與生產(chǎn)用藥的質(zhì)量。赤芍長于涼血，白芍長于補(bǔ)血，故二者的功效差異主要體現(xiàn)在涼血和補(bǔ)血兩個(gè)方面。其中赤芍、白芍補(bǔ)血作用的比較研究已另文發(fā)表[2,3]。本課題則從涼血方面入手。

根據(jù)溫病衛(wèi)氣營血的理論體系，溫病血分證是指溫邪深入血分，引起耗血?jiǎng)友鰺峄ソY(jié)所出現(xiàn)的證候[4]，其多發(fā)生于多種急性感染性和傳染性疾病的危重階段，而急性肺損傷（ALI）是此階段最易出現(xiàn)的一種并發(fā)癥。ALI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。但是，諸多組織學(xué)及病理學(xué)研究表明，早期過度的宿主應(yīng)答反應(yīng)和后期免疫細(xì)胞的異常凋亡是介導(dǎo)ALI病理損傷的關(guān)鍵原因[5,6]。中醫(yī)對此則認(rèn)為熱毒深入血分，迫血妄行是導(dǎo)致進(jìn)一步血分證其它病變的原始動因，治療應(yīng)首當(dāng)立足于清熱涼血。由此可見，中醫(yī)涼血的治法應(yīng)當(dāng)與機(jī)體的免疫異常密切相關(guān)。

肺泡巨噬細(xì)胞在ALI的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的免疫反應(yīng)中占有重要地位[7]。鑒于此本課題選擇大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞炎性損傷模型，觀察LPS對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞活性的影響及赤芍、白芍對LPS致NR8383細(xì)胞活性改變的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺泡巨噬細(xì)胞受LPS刺激后，首先過度持續(xù)活化表現(xiàn)在抑制率為負(fù)值，3h達(dá)到峰值，而后逐漸減緩6h后逐漸轉(zhuǎn)為快速凋亡，這與介導(dǎo)ALI病理損傷的過程是一致的，進(jìn)一步表明了肺泡巨噬細(xì)胞早期過度的應(yīng)答以及后期異常的凋亡是導(dǎo)致肺組織細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。在這一過程中，赤芍、川赤芍與白芍早期能夠抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞的過度激活，防止引起呼吸爆發(fā)；后期又能夠減少肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)肺損傷的作用。說明三者均對LPS誘導(dǎo)NR8383細(xì)胞活性的變化起到雙向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、維持穩(wěn)態(tài)的作用。但是，在LPS誘導(dǎo)后期，川赤芍、赤芍的作用明顯優(yōu)于白芍，這說明二者在涼血方面確有差異，是在共同具有涼血功效的前提下有所偏重。由此可見，今雖已有“白補(bǔ)赤瀉”的擇藥趨向，但二者在涼血方面是具有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)的，在臨床上應(yīng)可以交叉互換，這可通過以后的“功效成分組”的研究加以進(jìn)一步驗(yàn)證。

（致謝：感謝北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉勇老師在實(shí)驗(yàn)期間給予的大力支持。本實(shí)驗(yàn)受北京中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助）

[1] 中國國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:96.

[2] 李強(qiáng),周榮,楊偉鵬,等.赤芍、白芍補(bǔ)血作用比較研究(Ⅰ)[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(6):11-13.

[3] 李強(qiáng),周榮,楊偉鵬,等.赤芍、白芍對環(huán)磷酰胺所致的血虛證小鼠補(bǔ)血作用比較研究[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(1):19-21.

[4] 林培政.溫病學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:21.

[5] 呂進(jìn),王希良.流感病毒感染介導(dǎo)的免疫病理損傷研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009,36(8):961-967.

[6] Kitsmura Y,Hashimoto S,Mizuta N,et al.FasPFasL-dependent apoptosis of alveolar cells after lipopolysaccharide-induced lung injury in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,163( 3Pt1):762-769.

[7] 張偉,蔣耀光,李磊.肺泡巨噬細(xì)胞與急性肺損傷[J].創(chuàng)傷外科雜志,2003,5(5):389-391.

A Comparative Study on Content of Cooling Blood between Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba (Ⅰ) -Study on LPSstimulatedRat Alveolar Macrophages

SONG Yu-chao, LIAN Chao-jie, CUI Xiu-rong, LI Qiang*, LEI Hai-min
(Chinese Medicine College, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo study the effects of white peony roots and red peony roots on alveolar macrophages (NR8383) treated by LPS, comparing differences of blood-cooling between them.MethodMTT assay was used to detect the inhibitory rate of NR8383 induced by LPS at the different time and the role of white peony roots and red peony roots to the NR8383 induced by LPS.ResultFirstly, NR8383 cells were activated, and then were inhabited by LPS.White peony roots and Red peony roots can adjust the balance of NR8383 induced between activation and apoptosis.However, the role of red peony roots in the late time are much better than white peony roots.ConclusionThere are some differences between white peony roots and red peony roots under the common pharmacodynamic basis of blood-cooling.

Red peony roots; White peony roots; Lipopolysaccharide; Rat alveolar macrophages; Cell inhibitory rate

R282.05

B

1671-8194（2012）15-0004-03

10.15912/j.cnki.gocm.2012.15.653

*通訊作者