膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)在疾病預(yù)防控制領(lǐng)域檢驗(yàn)中的應(yīng)用分析

張 峰 李建新 戰(zhàn)祥彩 于燕群

山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東日照 276800

膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)基于酶免疫結(jié)合試驗(yàn)發(fā)展起來(lái)的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，因其具有單份測(cè)定、快速、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)在目前的臨床檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)除了使用商品試劑之外不需要其他儀器設(shè)備，且在數(shù)分鐘內(nèi)可肉眼觀察結(jié)果， 現(xiàn)將膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)的檢測(cè)原理以及在各類疾病預(yù)防控制領(lǐng)域檢驗(yàn)中的應(yīng)用報(bào)道如下。

1 膠體金免疫技術(shù)

膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如枸櫞酸鈉、抗壞血酸、鞣酸、白磷等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并在靜電作用下成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。 膠體金在弱堿條件下帶負(fù)電荷，可與帶正電荷基團(tuán)的蛋白質(zhì)分子形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以對(duì)蛋白質(zhì)的生物特性不造成影響。 膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如PHA、SPA、ConA 等。 根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如顏色反應(yīng)、顆粒大小、形狀及高電子密度，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，在組織學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)δz體金進(jìn)行廣泛地應(yīng)用。

膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。 吸附機(jī)理可能是蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)與膠體金顆粒表面負(fù)電荷因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。 用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑，也就是不同顏色的膠體金顆粒。 這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與免疫球蛋白、葡萄球菌A 蛋白、牛血清白蛋白多肽綴合物、抗生素、糖蛋白、毒素、酶、激素等非共價(jià)結(jié)合，因而成為基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中非常有用的工具。

2 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)原理

膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)用載體微孔濾膜包被已知的抗體或抗原，待檢標(biāo)本經(jīng)過(guò)濾膜的毛細(xì)管作用，膜上包被的抗原或抗體和標(biāo)本中的抗體或抗原結(jié)合，通過(guò)膠體金結(jié)合物實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。 目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是快速免疫金滲濾法 (Dot-immuogold Filtration Assay,DIGFA)和免疫層析法(Immunochromatogra-phy)，用于檢測(cè) 抗雙鏈DNA 抗體和HCG 、HBsAg 等，具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。

3 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)在疾病預(yù)防、控制、檢驗(yàn)方面的應(yīng)用

3.1 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)對(duì)細(xì)菌性疾病的檢驗(yàn)應(yīng)用

3.1.1 用于檢測(cè)鼠疫耶爾森菌 快速免疫金滲濾法檢測(cè)鼠疫耶爾森菌因其不與小腸結(jié)腸耶氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，因此具有良好的特性，最低檢出限為2.4×105cfu/mL。

免疫層析法檢測(cè)鼠疫耶爾森菌的靈敏度是1×105cfu/mL，用F1 抗體金探針檢測(cè)F1 抗原的最低檢出限10 μg/L，對(duì)土壤、面粉、奶粉、水、酵母粉以及淀粉等材料中的鼠疫耶爾森菌檢驗(yàn)，得到同樣的結(jié)果。

3.1.2 用于檢測(cè)沙門菌 采用抗原吸收法，使抗沙門菌在封閉的環(huán)境下與其他的腸道桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)，將標(biāo)記膠體金溶膠制成探針，然后采用多膜復(fù)合的方法制成免疫層析條，免疫層析的條靈敏度12.1×106cfu/mL，沙門菌不和其他腸道桿菌反應(yīng)，檢測(cè)108～1011cfu/mL 菌懸液并未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。 建立檢測(cè)沙門菌09抗氧的快速免疫金滲濾法，檢測(cè)沙門菌09 抗原單克隆抗體3-47-0 以及膠體金標(biāo)記親和純化的羊抗鼠IgG，檢測(cè)腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的靈敏度為6×104cfu/點(diǎn)，所有含09 抗原的沙門菌可用快速免疫金滲濾法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)不與其他的沙門菌、革蘭陽(yáng)性菌和腸桿菌科其他細(xì)菌反應(yīng)。

3.1.3 用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌 快速免疫金滲濾法用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌，最低檢測(cè)下限3.3×106～6.1×106cfu/mL。 檢測(cè)了12株大腸埃希菌和18 株不產(chǎn)毒素金黃色葡萄球菌，其中，各有一株發(fā)生了交叉反應(yīng)，志賀菌、沙門菌8 株，腐生菌、鏈球菌7 株都未發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.2 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)對(duì)病毒性疾病的檢驗(yàn)應(yīng)用

3.2.1 用于檢驗(yàn)艾滋病抗體 對(duì)18 家申報(bào)注冊(cè)艾滋病抗體快速檢測(cè)試劑實(shí)施臨床評(píng)價(jià)，300 份強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本18 家試劑檢測(cè)靈敏度均為100%；450 份健康獻(xiàn)血員樣品，15 家試劑（3 家未檢測(cè)）特異性為96.9%～100%；259 份高危人群樣品，18 家試劑靈敏度為73.6%～94.9%，特異性1 家為58.7%，其他大部分在95.3%以上。

3.2.2 用于檢驗(yàn)流行性出血熱抗體 用膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)，檢測(cè)80 份流行性出血熱患者血清均陽(yáng)性，采用膠體金免疫試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性80 份，靈敏度97.9%。檢測(cè)家貓血清、黑線姬鼠、兔免疫血清共10 份，檢測(cè)結(jié)果全部為陽(yáng)性。 檢測(cè)健康人群血清40 份，檢測(cè)結(jié)果全部陰性。 用膠體金免疫試劑盒檢測(cè)乙腦、鉤體病、乙肝、其他出血性疾病等220 份全部陰性。 用膠體金免疫滲濾法檢測(cè)60 份HFRS 患者血清中的抗?jié)h坦病毒IgM 抗體，16 份病程3 d內(nèi)，其中14 份陽(yáng)性，余下44 份病程4 d 及以上全部陽(yáng)性。

3.2.3 用于檢驗(yàn)柯薩奇病毒 因?yàn)榭滤_奇病毒易引起多種疾病，故研制了柯薩奇病毒IgM 抗體膠體金免疫層析診斷試紙條用于檢驗(yàn)薩奇病毒，檢測(cè)36 份血清，以RT-PCR 作為標(biāo)準(zhǔn)，膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)靈敏度96.3%，特異性66.8%。

3.3 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)對(duì)寄生蟲病的檢驗(yàn)應(yīng)用

3.3.1 血吸蟲抗體 用快速免疫金滲濾法檢測(cè)血吸蟲抗體，總靈敏度為96.8%，其中，急性血吸蟲患者靈敏度為99.9%，慢性患者靈敏度97.8%，晚期患者靈敏度92.8%。 血吸蟲流行區(qū)病人康復(fù)特異性83.1%，非流行區(qū)治愈病人特異性96.1%，20 例華支睪血吸蟲病人、198 例健康人均為陰性，總的特異性為96.1%。 快速免疫金滲濾法的特異性、靈敏度以及診斷效率和膠體金SEA-dipstick 方法相似。所謂膠體金SEA-dipstick 方法即用血吸蟲可溶性蟲卵抗原包被dipstick 硝酸纖維薄膜，該方法對(duì)于急性血吸蟲患者靈敏度為100%，對(duì)慢性患者靈敏度98.1%，對(duì)健康人檢測(cè)假陽(yáng)性為0.19%。

3.4 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)對(duì)其他微生物疾病的檢驗(yàn)應(yīng)用

3.4.1 用于檢測(cè)梅毒 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)可用于檢測(cè)臨床梅毒，與美國(guó)梅毒螺旋體特異性抗體膠體金法和日本富士公司的TPPA 試劑相比，我國(guó)的膠體金試劑盒檢測(cè)臨床病例，靈敏度以72.5%高于其他兩種試劑。 采用膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)孕婦血清、紅斑狼瘡患者以及其他正常體檢人群，得到孕婦血清35 例、紅斑狼瘡等其他患者血清80 例、正常體檢血清25 例均為陰性。

4 結(jié)語(yǔ)

膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)在疾病預(yù)防控制領(lǐng)域檢驗(yàn)中的應(yīng)用還見(jiàn)于破傷風(fēng)抗體、結(jié)核抗體、風(fēng)疹抗體、土拉菌、流感病毒、登革熱抗體以及衣原體等的檢測(cè)。 膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)以其操作快速、簡(jiǎn)便、不需要貴重儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，在疾病預(yù)防控制領(lǐng)域檢驗(yàn)中得到運(yùn)用。 然而，目前膠體金免疫試劑沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，致使大部分實(shí)驗(yàn)室使用自發(fā)研制的膠體金試劑，這就使得膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)的特異性、靈敏性 眾說(shuō)紛紜、不一致，因此在疾病預(yù)防控制領(lǐng)域有待進(jìn)一步完善膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 王培之，皮國(guó)華.膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2000,23(5):308-309.

[2] 何金林.膠體金免疫結(jié)合試驗(yàn)在疾病預(yù)防控制領(lǐng)域檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008,9(11):1012-1014.

[3] Spielberg F,Kabeya CM,Ryder RW,et al.Field testing and comparaman evaluation of rapid,visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus[J].Lancet,1989,1:580-584.

[4] Osikowicz G,Begge M.One -step chromatographic immunoassay for qualitative determination od chriogonadotropin in urine [J].Clin Chem,1990,36:1586.