肺炎鏈球菌流行病學研究進展

張天棟， 張 泓

肺炎鏈球菌流行病學研究進展

張天棟， 張 泓

肺炎鏈球菌； 耐藥性； 疫苗； 多位點序列分型

肺炎鏈球菌（SP）是臨床常見的主要病原菌之一，可以引起肺炎、中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎和敗血癥等疾病。據WHO估計［1］，每年大約有160萬人死于SP感染，其中5歲以下兒童占43.8%～62.5%，且大多數分布在發展中國家，SP性疾病（PD）成為5歲以下、疫苗可預防性疾病的首位致死因素。近些年來，SP的耐藥問題日趨嚴重，多重耐藥SP（MRSP）在世界范圍內播散，給臨床治療帶來新的挑戰。本文就SP的耐藥變化趨勢、主要耐藥及耐藥傳播機制、血清群／型分布和分子流行病學特征進行綜述。

一、耐藥趨勢

長期以來，抗生素在治療SP感染方面發揮著主導作用，但是近些年來常用抗生素，特別是β內酰胺類和大環內酯類抗生素的耐藥問題已演變成全球性的問題。自1967年首次在澳大利亞發現青霉素耐藥SP（PRSP）以來，世界各地不斷檢獲PRSP以及青霉素中介SP（PISP），PISP和PRSP統稱為青霉素不敏感SP（PNSSP）。據SENTRY 報道［2］，美國PNSSP（MIC＞2 mg／L）的檢出率2007年為11.4%，2008 年 上 升 至 13.5%，2009 升 高 至15.9%。歐洲國家PNSSP的檢出率，據EARSS［3］報道，德國、法國、英國和西班牙2008年分別為5%、30%、5%和23%，2010年分別為4%、28%、3%和30%。日本PNSSP的檢出率，2006年為4.0%，2007年為5.1%［4］。亞洲其他國家和地區PNSSP的檢出率，據 ANSORP報道［5］，2008—2009年韓國2.2%、越南0.9%、中國臺灣0.4%、中國香港1.5%。中國CHINET細菌耐藥性監測網報道［6-7］，我國大陸地區 PNSSP的檢出率，2009年為26.4%，2010年為23.4%。2008年CLSI修改了青霉素的折點判定標準，上述文獻報道的青霉素的不敏感率均采用新標準。雖然新標準下SP對青霉素的不敏感率處于較低水平，但我國PNSSP的檢出率顯著高于其他亞洲國家和地區，應引起廣大醫務工作者的足夠重視。

SP對大環內酯類抗生素的耐藥形勢十分嚴峻，紅霉素不敏感肺炎鏈球菌（ENSSP，MIC＞0.25 mg／L）的檢出率持續處于高位。據SENTRY項目報道［2］，2007年美國ENSSP的檢出率已高達32.6%，2009年則上升到39.2%。亞洲國家和地區SP對大環內酯類抗生素的耐藥狀況更為嚴峻，ANSORP對亞洲11個國2008—2009年臨床分離SP的回顧性研究顯示［5］，亞洲主要國家和地區ENSSP的檢出率日本66.7%、韓國81.7%、泰國51.4%、越南82.9%、我國香港75.5%、我國臺灣87.1%。我國大陸地區ENSSP的檢出率近些年來持續升高，據ANSORP［5］報道，2001年大陸地區ENSSP的檢出率為73.9%，到2009已攀升至96.4%，且檢出的ENSSP大都為極高水平耐藥菌株（MIC＞256 mg／L）。

二、主要耐藥機制及耐藥傳播機制

（一）β內酰胺類抗生素耐藥機制 SP對青霉素等β內酰胺類抗生素的耐藥性主要是通過青霉素結合蛋白（PBPs）的改變產生的，變構的PBPs減少了其對抗生素分子的親和性，從而導致了細菌耐藥的發生。現已發現在SP中有5個PBPs高分子量蛋白（PBPsla、lb、2x、2a、2b）和1個低分子量蛋白，多數SP青霉素耐藥是由PBP2x、PBP2b和PBPla這3個PBPs的改變引起的，PBP2x和PBP2b的改變與細菌的低水平青霉素耐藥有關，同時也是PBP-la改變介導的高水平青霉素耐藥的基礎。另外，非PBPs改變導致SP耐藥的機制近些年來也逐漸被人們認識，主要包括：①Cia H變異：Cia H基因編碼跨膜組氨酸激酶，該酶胞外N端有感應器功能，可感受周圍環境中的Ca2＋濃度變化，胞內C端有激酶活性，可激活胞質內轉錄調節蛋白CiaR，CiaR可調控多個目的基因的轉錄，這些目的基因可參與磷壁酸的修飾、糖類代謝調控和蛋白激酶的成熟等，從而對細菌細胞壁合成產生調控作用。Cia H基因缺失或突變會使SP信號轉導中斷，進而使CiaR不能發揮正常的轉錄調控作用，導致其對青霉素和頭孢噻肟耐藥，并對各種早、晚期細胞壁抑制劑（如環絲氨酸、桿菌肽、萬古霉素等）所致的細胞溶解產生很高的抵抗性［8-10］。②mur M：mur M基因編碼氨基酰連接酶，催化 Ala-t RNAAla或Ser-t RNASer連接到SP脂質代謝中間產物Ⅱ（肽聚糖合成中間產物）上，這些丙氨酸之間、丙氨酸與絲氨酸交叉連接，使SP細胞壁出現肽聚糖敷層，導致高水平青霉素耐藥及頭孢噻肟、頭孢曲松耐藥。但mur M基因單獨并不能引起SP耐藥，必須是在PBP2x、2b、1a基因變異的基礎上發揮作用［11-12］。

（二）大環內酯類抗生素耐藥機制 SP對大環內酯類抗生素的耐藥機制主要包括：①核糖體靶位點的改變：主要由ermB基因介導，ermB基因編碼核糖體甲基化酶，可以使SP核糖體50S亞基23Sr RNA 2058位的腺嘌呤殘基二甲基化，該位點是大環內酯類抗生素結合到細菌核糖體的關鍵位點，2058位腺嘌呤殘基二甲基化降低了大環內酯類抗生素與核糖體的親和力。該機制引起大環內酯類抗生素高水平耐藥（紅霉素MIC＞64 mg／L），且與林可酰胺類抗生素和鏈陽菌素B交叉耐藥，耐藥表型為MLSB。ermB在SP中由可結合轉座子Tn1545或Tn3872攜帶，因erm B上游調控序列的不同，MLSB又可分為c MLSB（結構型）和i MLSB（誘導型），后者主要對14元環、15元環大環內酯類抗生素耐藥，對林可酰胺類抗生素及鏈陽菌素敏感，對16元環大環內酯類抗生素部分敏感。②主動外排機制增強：由mef基因編碼的主動外排泵介導，促進藥物外排對14、15元環大環內酯類抗生素低水平耐藥（紅霉素MIC 1～32 mg／L），而對16元環大環內酯類抗生素、克林霉素和鏈陽菌素B敏感。③核糖體突變：除以上兩種主要耐藥機制外，近年來研究證明核糖體突變也可導致大環內酯類抗生素耐藥，迄今為止發現的核糖體突變包括23Sr RNA突變和（或）編碼L4、L22蛋白基因突變。Reinert等［13］研究證實，與SP對大環內酯類抗生素耐藥相關的23Sr RNA突變主要包括A138→G、A373→T、A260→G、T389→C、A449→C和A1745→T，突變的23Sr RNA降低了其與大環內酯類抗生素的親和力，從而導致了SP耐藥的發生。L4、L22蛋白突變導致大環內酯類抗生素耐藥的機制學者有不同的認識。Depardieu等［14］認為是突變的L4、L22蛋白通過與23S r RNAⅠ區結合，擾亂了Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ區的構象，從而影響Ⅴ區轉肽酶中心附近位點與抗生素的結合，降低了藥物的抗菌活性。沈敘莊等［15］認為是L4蛋白修飾使多肽鏈通道變窄，致使大環內酯類抗生素結合部位遠離該通道而失效。與L4蛋白突變相反，L22蛋白突變使得多肽鏈通道變寬，以無效的方式結合大環內類抗生素。需要指出的是，不同耐藥機制在不同國家和地區的分布是不同的，SP對大環內酯類抗生素的耐藥性在歐洲和亞洲主要是由ermB基因介導的，在北美主要是由mef基因介導的。我國檢出的大環內酯類抗生素耐藥表型以MLSB型居多，但erm B（＋）mef A／E（＋）表型SP在我國正呈逐年上升的趨勢。

（三）耐藥傳播機制 SP的耐藥性主要通過2條途徑傳播：①克隆傳播。同一來源菌株在人群中傳播，通過旅游、接觸等途徑造成流行。②水平傳播。耐藥基因經轉化、轉導或接合轉座子接合轉移給敏感菌，使后者產生耐藥性，耐藥基因可來自耐藥性SP或其他種屬細菌。國外研究發現，轉座子在SP耐藥進化中起重要作用，與質粒DNA無關的耐藥性傳遞主要由轉座因子完成。目前主要與耐藥相關的轉座子和轉移方式有：①Tn916-1545接合轉座子家族［16-17］。可攜帶大環內酯類抗生素耐藥基因ermB、四環素類耐藥基因tet M、和卡那霉素耐藥基因aph A-3，并能在無質粒帶動下在同種或不同種的細菌間進行接合轉移。②Tn1207.1［18］和mega插入元件［19］。攜帶大環內酯類抗生素外排基因mef A或mef E及ABC外排系統，編碼細菌對抗菌藥物的外排作用，經轉化和同源重組轉移播散。③復合轉座子Tn2009［20］。由帶有大環內酯外排基因mef E的mega插入元件整合到1個帶有四環素耐藥基因tet M的Tn916類轉座子上形成，其上還攜帶了與金葡菌轉運蛋白msr D基因高度同源的序列，可能與mef E共同編碼SP對藥物的主動外排。Tn2009可經轉化使敏感菌株獲得耐藥性。SP染色體上的轉座子可捕獲其他耐藥元件形成多重耐藥復合轉座子，且攜帶耐藥基因的轉座子具有廣泛的宿主范圍，可經多種轉移方式引起耐藥基因在相同或不同種屬細菌中水平傳播，還可穩定地傳給子代，隨耐藥菌株克隆播散。

三、血清群／型分布和SP疫苗應用

根據莢膜多糖免疫原性的不同，SP可分為93種血清型，但多數血清型很少引起疾病，世界范圍內至少70%～75%的侵襲性PD（IPD）是由13種常見的血清型引起的。SP疫苗是預防其感染的重要手段。Pilishvili等［21］的調查顯示PCV7應用后，IPD在美國整體人群的發病率下降了45%；Shea等［22］的調查顯示，急性中耳炎在3歲以下美國兒童中的發病率下降了12%。與疾病相關的血清群／型可隨時間、地點、年齡不同而變化。西班牙的一項調查顯示［23］，PCV7覆蓋的血清型（23F除外）從20世紀80年代早期開始增長，一直到本世紀初開始下降；非PCV7覆蓋的1、5、7F則從20世紀80年代起開始下降，一直到20世紀90年代末期血清型1、5、6A、7F和19A開始迅速增長。國內Yao等［24］的調查顯示，當前我國兒童感染SP的主要血清型為19F、19A、23F、6B和14，但19A在小于2歲嬰幼兒中比在2～5歲兒童中常見，14型SP則相反。選擇或研制疫苗前應首先了解本地區SP的血清群／型構成，疫苗應能覆蓋主要血清型尤其是多重耐藥菌株的血清型，才能達到良好的效果。

PCV7應用后，疫苗覆蓋的血清型有了顯著下降，非疫苗覆蓋的血清型有了穩定提升，我們稱之為“血清型替換”。PCV7應用后，在法國和我國香港PCV7覆蓋的血清型分別下降了26.0%和23.8%，非PCV7覆蓋的血清型分別上升了32.5%和28.7%；在美國和蘇格蘭由PCV7覆蓋血清型引起的IPD分別下降了94%和15%，非PCV7覆蓋血清型引起的IPD分別上升了3.4～7.1例／10萬和2.1～3.5例／10萬［21，25］。研究發現，SP疫苗還可以延緩細菌耐藥性的產生和擴散。PCV7應用后，PNSSP和ENSSP的檢出率美國社區獲得性呼吸道感染患者分別下降了37.3%和34.8%，歐洲小于5歲兒童分別下降了39.6%和39.5%［25-28］。但 SP 疫苗對抗生素耐藥率的影響可能因血清型而異，在使SP耐藥率整體下降的同時，PCV7可能導致非疫苗覆蓋血清型菌株的耐藥率升高。Farrell等［27］的調查顯示，PCV7應用后，非疫苗覆蓋的PNSSP、ENSSP和MRSP在美國兒童中的檢出率分別升高了45.1%、44.3%和28.5%。因此，SP疫苗對抗生素耐藥率的影響還需要進行長期的綜合評估。

四、多位點序列分型（MLST）

要區分SP耐藥性的傳播方式，了解耐藥克隆的遺傳背景，追蹤耐藥株的起源和進化路徑，必須借助于分子生物學的方法。MLST是在多位點酶電泳的基礎上發展起來的，通過對SP的管家基因直接測序和與基因庫中已知序列的等位基因進行序列對比，分析菌株間的序列差異和關系，從而追蹤耐藥菌株間的親緣關系及播散途徑，實現了在互聯網上比較和分析不同實驗室間結果的可能。

目前MLST數據庫中，已經收錄了SP 4000多種ST，這些數據可以供全球不同實驗室之間進行結果的分析對比，而且可以隨時補充新的數據，肺炎鏈球菌分子流行病學監測網（PMEN）利用這些數據將SP分為43個耐藥克隆，研究表明不同國家的流行ST和ST克隆群是不同的。在美國，主要流行ST為ST199，ST 克隆群為 M254-15B［28］；在日本，主要流行ST為ST90、ST236和ST242，ST克隆群為Spain6B-2、Taiwan19F-14 和 Taiwab23F-15［29］；在中國，主要流行ST為ST320、ST271和ST876，ST克隆群為 Taiwan19F-14［30］。研究同時表明，不同血清型的流行ST也是不同的。在美國，主要血清型19A的流行ST為ST199［28］；在日本，主要血清型的流行 ST：6B 為 ST90，19F 為 ST236 和ST2993，23F 為 ST242、ST356 和 3ST81［29］；在中國，主要血清型的流行ST：19F為ST271，14為ST876和 ST790，19A 為 ST320，6B為 ST90和ST3263，23F為ST81和 ST342［30］。還有文獻報道證實，不同ST的抗生素耐藥率也存在差異。例如，在日本，ST90、ST236和ST242構成了36.4%的MRSP［29］；在中國，ST320和 ST271則構成了兒童IPD中31.0%的多重耐藥PMEN克隆群 Taiwan19F-14［30］。另外，PCV7應用后，由于“血清型替換”，19A型SP大量出現，在某些國家，如美國和中國，19A甚至成為了主要血清型，在多數國家19A的大量出現與ST320的播散有關，在美國則是ST199播散的直接結果。

MLST還可用于基因變異率的評估和非典型菌株的鑒定。研究發現，SP的7個管家基因中，以xpt的變異率最高，這是新型ST不斷涌現的重要原因之一。Ing等［31］還曾用 MLST對非典型菌株進行定型，并與目的基因ply、psa A的PCR結果相互參照，實現了非典型SP的鑒定。

五、展望

SP感染嚴重威脅著兒童的健康，積極防治PD將加速聯合國千年發展目標的實現。避免抗生素濫用是目前公認的較好的控制SP耐藥發生和發展的主要途徑。除此之外，建立細菌耐藥監測網，并借助于MLST等分子生物學的方法追蹤細菌的耐藥起源和播散途徑，可以為臨床更好的控制SP耐藥性的發生和發展提供有力的依據。SP疫苗的有效性已經得到證實，但是由于SP血清型分布的人群和地域差異，不同地區應用后的效果還有待于進一步的評估。“血清型替換”是降低SP疫苗效能的主要原因之一，非疫苗覆蓋的血清型在耐藥率方面也出現了不利的一面，這些方面的研究都有待于進一步的展開。

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Advance in the epidemiological researches ofStreptococcuspneumoniae

ZH ANGTiandong，ZHANGHong. （DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiChildren′sHospital，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200040，China）

R378.1

A

1009-7708（2012）06-00472-05

上海市自然科學基金（09ZR14275）。

上海市兒童醫院，上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，200040。

張天棟（1986—），男，在讀碩士，主要從事細菌耐藥機制及分子流行病學研究。

張泓，E-mail：zhanghong3010＠126.com。

2012-05-14

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