福建省鼠傷寒沙門菌PFGE分子分型和耐藥的關聯性研究＊

楊勁松，陳建輝，林 杰，鄭金鳳，嚴延生，陳愛平

福建省鼠傷寒沙門菌PFGE分子分型和耐藥的關聯性研究＊

楊勁松，陳建輝，林 杰，鄭金鳳，嚴延生，陳愛平

目的 分析福建省鼠傷寒沙門菌的脈沖場凝膠電泳（PFGE）分子分型和耐藥結果之間的關聯性，探討二者的內在聯系。方法對福建省66株鼠傷寒沙門菌進行PFGE分子分型和藥敏試驗，并對分子分型和藥敏試驗結果進行關聯性分析。結果66株鼠傷寒沙門菌分為32個PFGE型，P1、P8型為優勢型別，其中40．9%（27／66）的菌株為P1型，10．6%（7／66）的菌株為P8型，51．52%（34／66）的試驗菌株歸于P1和P8型別；耐藥結果經聚類分析，可將抗生素分為4類，其中頭孢類和環丙沙星（氟喹諾酮類）是較高敏感藥物，敏感率分別為94．42%（61／66）和62．12%（41／66）；P1型在多重耐藥嚴重的菌株中（＞6耐）為優勢型別，占該類菌株數的56．82%，以6耐為分界，P1型菌株在兩組中的分布存在差異，具有統計學意義；P8型菌株在兩組中的分布差異無統計學意義。結論P1和P8型是福建省鼠傷寒沙門菌的PFGE分型的優勢基因型，其中P1型與多重耐藥嚴重的菌株（＞6耐）間存在關聯性；頭孢類和環丙沙星（氟喹諾酮類）仍是當前治療福建省嚴重耐藥鼠傷寒菌的主要藥物。

鼠傷寒沙門菌；脈沖場凝膠電泳；分子分型；耐藥性；關聯性

沙門菌血清型種類繁多，1975－2003年在福建省全省50多個縣 （市、區 ）開展了人、動物、食品及污水等外環境沙門菌血清型分布特征及與疾病關系的調查，發現鼠傷寒沙門菌是我省最常見血清型之一［1］。近年來，福建省鼠傷寒菌食物中毒事件屢有發生，鼠傷寒菌醫院內感染也多次報道。本研究采集本省2009－2010年鼠傷寒沙門菌，對PFGE分型和耐藥結果進行分析，探討PFGE帶型與耐藥譜的關聯性，為早期發現鼠傷寒菌的暴發流行調查以及預測多耐菌的流行趨勢提供基礎研究數據。

1 材料和方法

1．1 實驗菌株 66株鼠傷寒沙門菌分離自我省2009－2010年沙門菌感染患者和健康體檢者，均經我中心細菌科復核鑒定。PFGE標準Marker菌株H9812由全國病原體監測網絡PulseNet China提供。1．2 主要儀器 Bio－Rad公司的CHEF MAPPER脈沖場凝膠電泳儀和Gel Doc XR＋ 凝膠成像系統，Bio Merieux Vitek公司的DENSIMAT細菌濁度儀。

1．3 主要試劑 沙門菌診斷血清購自泰國S＆A公司，微量生化管購自廣東省環凱微生物科技有限公司，15種藥敏紙片和水解酪蛋白（MH）瓊脂均購自英國OXOID公司。Seakem Gold Agarose PFGE級瓊脂糖購自Lonza公司，XbaⅠ限制性內切酶以及蛋白酶K購自美國NEB公司。上述實驗材料均在有效期內使用。

1．4 藥敏試驗 藥敏測定采用WHO推薦的瓊脂擴散法（K－B法），參照美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS 2005）頒布的抑菌環直徑診斷標準判定結果，每次試驗均采用大腸菌國際標準株ATCC 25922作質控對照。

1．5 PFGE實驗方法 根據PulseNet網絡實驗室推薦的標準方法（美國CDC）完成66株鼠傷寒沙門菌的PFGE的脈沖場凝膠電泳圖譜。

1．6 數據分析 PFGE圖像導入BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）軟件包進行處理，選擇Dice相關系數和UPGMA方法，tolerance設置為1．5%。采用SPSS 15．0軟件包對藥敏結果進行分析，對抗生素進行R聚類。胺、甲氧芐啶、復方新諾明、四環素。結果顯示菌株對頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻吩四種藥敏結果完全一致，即這4種藥對同一菌株的藥敏結果相同。將這4種藥合并為頭孢類；對甲氧芐啶、復方新諾明的藥敏結果完全一致，將這兩種藥合并為部分磺胺類。將15種抗生素歸納為11類，66株鼠傷寒沙門菌11類抗生素耐藥譜的菌株分布情況見表1。

2．3 抗生素聚類分析 根據鼠傷寒沙門菌對所測試11類抗生素的敏感情況，可將抗生素大致分為4類：第1類包括頭孢類和環丙沙星，鼠傷寒沙門菌對該類藥物敏感性高；第2類藥物包括氯霉素、部分磺胺類和慶大霉素，鼠傷寒沙門菌對該類藥物敏感性中等；第3類包括氨芐西林、四環素、萘啶酸、鏈霉素和磺胺等藥物，鼠傷寒沙門菌對該類藥物敏感性較差；第4類藥耐藥性中介狀態較多，如：阿莫西林＋棒酸。

2．4 66株鼠傷寒沙門菌耐藥譜的PFGE型別分布情況 66株鼠傷寒沙門菌中優勢型別P1和P8型菌株共占51．52%，各耐藥組菌株PFGE型別分布存在差異，其中6耐、7耐、8耐、9耐組中P1和P8優勢型別分布最多，分別為100%（3／3）、61．54%（8／13）、80．0%（16／20）、71．43%（5／7）。具體結果見表2。其它PFGE型別在各耐藥譜中的分布比較分散。

2．5 耐藥譜與PFGE優勢型別的關聯性 將11類耐藥譜分為2組，即0～5耐和6～10耐組。各耐藥組中PFGE優勢型別菌株的分布見表3。

2 結 果

2．1 鼠傷寒沙門菌PFGE分型結果 66株鼠傷寒沙門菌用XbaⅠ酶切并進行脈沖場電泳后，DNA片段可得到較好地分離，可見大小不一的電泳條帶，分子量從18～1 162 kb；菌株條帶數目在12～20之間。利用Bio Numerics軟件的Cluster analysis模塊進行聚類分析，菌株間條帶相似度在64．8%～100%之間；按照95%的相似度可將菌株酶切圖譜分為32個PFGE型，其中P1型有27株，P8型有7株，P7、P18型各有2株，其余各型均為1株，P1、P8型為優勢型別，見圖1。

2．2 鼠傷寒沙門菌藥敏結果 對鼠傷寒沙門菌進行15種抗生素的藥敏試驗，包括：氨芐西林、阿莫西林＋棒酸、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻吩、氯霉素、環丙沙星、慶大霉素、萘啶酸、鏈霉素、磺

圖1 66株鼠傷寒沙門菌XbaⅠ酶切聚類分析Fig．1 Cluster analysis of 66 S．typhimurium strains with XbaⅠin PFGE test

表1 66株鼠傷寒沙門菌耐藥譜情況Tab．1 The drug resistance spectrum of 66 S．typhimurium strains

經卡方檢驗，χ2P1＝13．821，P1型＜0．001；χ2P8＝2．417，P8型＞0．05，即認為P1型菌株在兩組中的分布存在差異，并具有統計學意義；P8型菌株在兩組中的分布差異無統計學意義。

3 討 論

本次研究將本省兩年來搜集的66株鼠傷寒菌進行PFGE分型，采用XbaⅠ內切酶，按照95%的相似度可將菌株酶切圖譜分為32個PFGE型，其中P1型有27株，P8型有7株，二者占到總數的51．52%，為福建省鼠傷寒菌的優勢帶型。本次PFGE試驗結果為進一步深入研究，同時也為早期發現鼠傷寒沙門菌的暴發流行提供基礎的實驗數據。

表2 66株鼠傷寒沙門菌耐藥譜的PFGE優勢型別分布情況Tab．2 Distribution of the prevalent PFGE types in drug resistance spectrum of 66 S．typhimurium strains

表3 鼠傷寒沙門菌各耐藥組PFGE優勢型別分布Tab．3 Distribution of the prevalent PFGE types in two drug resistant groups

隨著大量抗生素的濫用，病原菌耐藥性已成為全球亟待解決的問題。近年來我省監測結果顯示，鼠傷寒沙門菌耐藥率有逐年大幅上升之勢，耐藥譜迅速增寬，多重耐藥菌株逐年急劇增多。因此，定期進行鼠傷寒菌耐藥性監測，掌握其變遷趨勢，選擇敏感藥物，是控制鼠傷寒菌病暴發和流行的重要環節。謝一俊等［2］對福建省1980－1995年鼠傷寒沙門菌進行耐藥監測顯示氟哌酸等氟喹諾酮藥物、第3代頭孢菌素（包括大部分1、2代頭孢菌素）和丁胺卡那霉素的敏感率達100% ，是當時治療福建省嚴重耐藥鼠傷寒菌的敏感藥物。許學斌等［3］對上海市鼠傷寒沙門菌腹瀉株、食品株、本市食品從業人員的體檢株進行連續性耐藥監測認為：本市鼠傷寒沙門菌的總體耐藥表型穩定，存在DT104等多重耐藥株，并有增多的趨勢。本次鼠傷寒沙門菌耐藥結果經聚類分析，可將抗生素分為4類，其中頭孢類和環丙沙星（氟喹諾酮類）是較高敏感藥物，鼠傷寒菌對這兩類抗生素的敏感率分別為94．42%（61／66）和62．12%（41／66），敏感率出現了一定程度的下降，表明鼠傷寒菌耐藥情況日益嚴重，與上海市的監測結果相符，但該藥物仍是當前治療福建省嚴重耐藥鼠傷寒菌的主要藥物。

將PFGE分子分型和細菌的耐藥譜進行關聯性分析是本課題的探索性研究，通過關聯性分析以期發現在耐藥的菌株間是否存在某種特定的PFGE基因型別，根據PFGE分型能夠及時預測菌株的耐藥流行趨勢，防控耐藥菌的傳播。本課題兩者關聯性分析結果提示：P1型在不同耐藥譜中的分布，以6耐為分界，存在明顯的差異，P1型在大于6耐組的分布率及構成比均遠遠高于6耐以下組，P1型在7耐、8耐和9耐的分布率分別為53．84%、55．0%和57．14%，表明P1型的分布與耐藥譜的級數存在一定的關聯性。也就是說在多重耐藥嚴重的鼠傷寒沙門菌中（大于6耐），P1是該組耐藥譜菌株的常見基因型，同時P8型在各耐藥組的分布率雖然無統計學差異，但構成比差異明顯（P8型全部分布在6～10耐組），需要增加樣本例數才能得到更為準確的結論。在實際工作中，發現菌株PFGE帶型屬于P1型則可以推測該菌株藥敏結果很可能為多耐（多于6耐）菌株，為預測鼠傷寒沙門菌的耐藥流行趨勢提供了另一種實驗的依據。我們還需不斷加大監測力度，搜集更多菌株以充實數據庫，探索P1型、P8型乃至其他PFGE型別與特定耐藥譜的關聯性。

［1］謝一俊，鄭國櫆，陳建輝，等．福建1975－2003年沙門菌監測結果分析［J］．海峽預防醫學雜志，2004，10（6）：7－10．

［2］Swaminathan B，Barrett TJ，Hunter SB，et al．PulseNet：the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance，United States［J］．Emerg Infect Dis，2001，7（3）：382－389．

［3］謝一俊，陳亢川，林成水．福建省鼠傷寒沙門菌病原學特征研究［J］．海峽預防醫學雜志，2002，8（3）：1－3．

［4］許學斌，金匯明，肖文佳．上海市鼠傷寒沙門菌流行特征及分子分型研究［J］．上海預防醫學雜志，2010，22（2）：57－61．

Association between PFGE molecular typing and drug resistance of Salmonella typhimurium in Fujian

YANG Jin－song，CHEN Jian－hui，LIN Jie，ZHENG Jin－feng，YAN Yan－sheng，CHEN Ai－ping

（Fujian Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350001，China）

To study the association between PFGE molecular typing and drug resistance of Salmonella typhimurium in Fujian，we carried out PFGE experiment and susceptibility test within 66 strains of S．typhimurium n，and conducted association analysis．The 66 S．typhimurium were divided into 32 PFGE types．A 40．9%（27／66）of them were P1，and 10．6%（7／66）were P8，there were 51．52%（34／66）strains classified into P1 and P8，which were the prevalent types．In the drug resistance test，antibiotics were divided into 4 groups with cluster analysis，in which，cephalosporin and ciprofloxacin（quinolone）were hypersensitive，and the sensitive rates were 94．42%（61／66）and 62．12%（41／66）respectively；P1 was the prevalent type in multidrug resistant strains（more than 6 resistant），amounting for 56．82%of the total．The distribution of P1 had statistical significance between the group“more than 6 strains resistance"and the group"less than 6 strains resistance"，while the distribution of P8 had no statistical significance between these two groups．Therefore，P1 and P8 were the prevalent gene types，and there was relationship between P1 and multidrug resistant strains（more than 6 strains resistance）．At present，cephalosporin and ciprofloxacin（quinolone）are still the main antibiotics to treat Salmonella typhimurium in Fujian．

Salmonella typhimurium；PFGE；molecular typing；drug resistance；association

R117

A

1002－2694（2012）01－0010－04

＊國家科技重大專項“傳染病監測技術平臺”項目（2009ZX10004－210）；福建省衛生廳青年基金課題資助計劃（No．2010－1－23）

陳愛平，Email：cap2006＠live．cn

福建省疾病預防控制中心，福州 350001

2011－07－19；

2011－09－28