微小隱孢子蟲重組蛋白CP23與CP15/60－23免疫原性的研究＊

張 珍，劉春會，杜鎮(zhèn)鎮(zhèn)，王 冬

微小隱孢子蟲感染引起的隱孢子蟲病（Cryptosporidiosis）是一種全球性以腹瀉為主要癥狀的人獸共患寄生蟲病。篩選出免疫原性較強(qiáng)的基因片段，用于此病的免疫診斷、預(yù)防與治療，是防治此病的主要手段之一［1］。有學(xué)者研究表明，微小隱孢子蟲CP23基因編碼的蛋白是宿主免疫識別的主要蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)；CP15/60、CP15等也以其較強(qiáng)的免疫原性，有望成為免疫診斷、免疫預(yù)防與治療的靶抗原［2］。本課題前期研究中成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒p ET－30a－23和p ET－30a－15/60－23復(fù)合基因載體，誘導(dǎo)表達(dá)了大量的重組蛋白 CP23 和 CP15/60－23［3］。為進(jìn)一步觀察重組蛋白CP23、CP15/60－23的免疫原性，將其配以免疫佐劑免疫小鼠，分別檢測小鼠的體液和細(xì)胞免疫功能及抗隱孢子蟲的感染能力，從而為人類隱孢子蟲多價(jià)亞單位疫苗的研用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c小鼠60只，雌雄各半，SPF級，體重14～16g，購于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 重組蛋白CP23和CP15/60－23由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)和純化；1640培養(yǎng)液（上海克隆生物高技術(shù)公司）；小牛血清（上海復(fù)旦天呈公司）；堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG結(jié)合物及兔抗大鼠IgG結(jié)合物；小鼠IFN－γ、IL－12檢測試劑盒均為晶美生物工程公司產(chǎn)品；MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems公司）；FC500型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫 BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組20只。分別為磷酸緩沖液（PBS）對照組、重組蛋白CP23免疫組、重組蛋白CP15/60－23免疫組。每只小鼠背部皮下多點(diǎn)注射弗氏完全佐劑和抗原混合物共100μL/只，對照組注射同量佐劑與PBS的混合物。每隔2w免疫1次，共免疫3次。每次免疫前剪尾取血，最后一次免疫2w后，75%的酒精消毒，摘眼球取血，收集血清，用于檢測抗體及細(xì)胞因子。

1.2.2 小鼠特異性IgG抗體檢測 采用間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中特異性抗體，包被抗原為大腸埃希菌表達(dá)的重組CP23蛋白、重組CP15/60－23蛋白。用1%小牛血清（BSA）封閉，不同稀釋度各組免疫鼠血清、正常鼠血清為一抗、羊抗鼠IgG－AP結(jié)合物為二抗，對硝基苯基磷酸鈉（p NPP）底物顯色，酶標(biāo)儀測吸光度（A405值）；檢測孔A405＞2.1陰性對照（正常鼠血清）孔A405者判為陽性，計(jì)算血清IgG抗體滴度，動態(tài)檢測免疫小鼠特異性抗CP23、CP15/60－23的抗體。

1.2.3 小鼠脾臟T細(xì)胞CD＋4、CD＋8亞群檢測 末次免疫后2w，隨機(jī)取各組BALB/c小鼠各5只，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106/m L，分別加入 FITC－CD3/PE－CD4 和 FITC－CD3/PE－CD8單抗，混勻后室溫放置30 min后用流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算T細(xì)胞亞群CD＋4、CD＋8的百分率和CD＋4/CD＋8比值。

1.2.4 小鼠細(xì)胞因子的檢測 將脾細(xì)胞懸液濃度調(diào)至6.4×107/m L，分別滴入96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.2 m L，培養(yǎng)3 d后，收集上清。取培養(yǎng)液上清包被96孔反應(yīng)板，常規(guī)ELISA法檢測IFN－γ、IL－12。

1.2.5 卵囊攻擊感染 第3次免疫2周后，將各組剩余BALB/c小鼠計(jì)45只（每組15只），分別灌胃接種1×106個(gè)卵囊，于接種第3 d開始收集小鼠糞便并稱重，用簡化的不連續(xù)蔗糖密度梯度離心法提取、純化糞便中的卵囊，檢測卵囊排出情況，計(jì)算平均每克糞便中卵囊數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間CD＋4、CD＋8百分率及細(xì)胞因子之間的比較用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IgG抗體滴度比較 隨著免疫次數(shù)的增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫血清中IgG抗體滴度都逐漸升高，尤其是重組CP15/60－23免疫后血清中IgG抗體滴度升高更為明顯，見表1。

表1 3次免疫后小鼠血清中IgG抗體平均幾何滴度Tab.1 The dynamic results of IgG in serial serum of mice

2.2 T淋巴細(xì)胞百分率比較 第3次免疫后2w，小鼠脾臟T細(xì)胞CD＋4、CD＋8百分比及CD＋4/CD＋8都增高，與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.01），兩實(shí)驗(yàn)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 免疫后小鼠脾T細(xì)胞CD4＋、CD8＋及百分比值（±s）Tab.2 The percentages of CD4＋and CD8＋T lymphocytes in mice spleen after immunization±s）

表2 免疫后小鼠脾T細(xì)胞CD4＋、CD8＋及百分比值（±s）Tab.2 The percentages of CD4＋and CD8＋T lymphocytes in mice spleen after immunization±s）

※與對照組相比有差異，P＜0.05。

組 別CD＋4（%）CD＋8（%）CD＋4/CD＋8 PBS對照組24.18±3.30 9.92±1.14 2.44±0.16重組蛋白CP23組 44.02±2.29※ 14.98±1.05※ 2.95±0.29※重組蛋白CP15/60－23組 47.15±2.47※ 15.92±0.98※ 2.93±0.26※

2.3 細(xì)胞因子IFN－γ檢測結(jié)果 單因素方差分析結(jié)果表明，經(jīng)抗原刺激后的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN－γ的滴度都有不同程度的增加，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重組蛋白CP23組IFN－γ平均幾何滴度為8.98，重組蛋白 CP15/60－23組為16，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 細(xì)胞因子IL－12檢測結(jié)果 單因素方差分析結(jié)果表明，經(jīng)抗原刺激后的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL－12的滴度都有不同程度的增加，與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重組蛋白CP23組IL－12平均幾何滴度為8.00，重組蛋白 CP15/60－23組為11.31，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 攻擊感染后糞便卵囊比較 用微小隱孢子蟲卵囊接種免疫后的小鼠，各組小鼠糞便中的卵囊數(shù)量都很低，實(shí)驗(yàn)組小鼠的潛伏期延長，卵囊排出期亦略縮短，各組之間無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 攻擊感染后各組小鼠卵囊排出結(jié)果Fig.1 Comparison of oocysts shedding after challenge

3 討 論

目前隱孢子蟲感染的保護(hù)性免疫機(jī)制尚不清楚。有研究認(rèn)為體液免疫和細(xì)胞免疫在抗隱孢子蟲感染中都起一定作用，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為以細(xì)胞免疫為主，尤其CD＋4細(xì)胞的增加發(fā)揮很大作用，IFN－γ與IL－12亦可使卵囊排出減少，對抵抗感染起一定作用［4］。本研究結(jié)果用重組 CP23及 CP15/60－23抗原免疫小鼠后，小鼠脾臟T細(xì)胞CD＋4、CD＋8及CD＋4/CD＋8也增加，說明兩種重組抗原體內(nèi)都能刺激淋巴細(xì)胞增殖，尤其CD＋4T淋巴細(xì)胞的增殖更為明顯。此研究結(jié)果還顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫血清中IgG抗體滴度都逐漸升高，尤其是重組蛋白CP15/60－23組升高更為明顯，并且兩種重組抗原都可在體外刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生大量的保護(hù)性細(xì)胞因子IFN－γ和IL－12。

本實(shí)驗(yàn)用卵囊攻擊感染免疫后的小鼠，各組小鼠糞便中的卵囊數(shù)量都很低，各組之間無明顯差異。這可能與感染動物的年齡因素有關(guān)，黃克和等［5］亦證實(shí)成年小鼠對隱孢子蟲感染有抵抗性，而2w齡以內(nèi)的小鼠則容易感染，本實(shí)驗(yàn)小鼠周齡均較長，因此皆不易受感染。

總之，本研究不僅證實(shí)CP23可被T細(xì)胞識別，是潛在的B細(xì)胞的免疫原，是增殖反應(yīng)和血清學(xué)研究的理想對象［6］，還證實(shí)了聯(lián)合重組抗原CP15/60－23也有很好的免疫活性，與重組CP23一樣，體內(nèi)能刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，刺激CD＋4淋巴細(xì)胞增殖，體外刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子，兩者都可以作為亞單位疫苗的理想侯選抗原，而且具有純度高，制備簡便等優(yōu)點(diǎn)。有望研制出效果優(yōu)異的亞單位疫苗以用于隱孢子蟲病的預(yù)防。

［1］柏雪蓮，張玉梅，周秀芝，等.微小隱孢子蟲pcDNA3.0－23重組質(zhì)粒免疫效果評價(jià)［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26（8）：1007－1009.

［2］黃炳成，李瑾，魏慶寬，等.微小隱孢子蟲重組 BCG－CP15/60－23疫苗免疫原性的研究［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2008，3（12）：920－922.

［3］宰德富，張佃波，魏慶寬，等.微小隱孢子蟲CP23基因的克隆及表達(dá)［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2006，1（3）：193－196.

［4］Tessema TS，Dauber E，Petry F.Adoptive transfer of protective immunity fromCryptosporidiumparvum－infected interferon gamma and interleuk in－12－deficient mice to naive recipients［J］.Vaccine，2009，27（47）：6575－6581.

［5］黃克和，楊世廣，唐建霞.從感染小鼠獲得微小隱孢子蟲卵囊方法的改進(jìn)［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2001，19（6）：360－362.

［6］Smith LM，Priest JW，Lammie PJ，et al.Human T and B cell immunoreactivity to a recombinant 23－k DaCryptosporidium parvumantigen［J］.J Parasitol，2001，87（3）：704－707.